哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

CRISPR 筛选的剔除筛选为研究人员提供了一种简单、高效且经济的方法，用于在全基因组水平上探究基因功能。CRISPR 的优势在于其灵活性，只需改变向导序列即可编辑任意基因。CRISPR 向导文库使研究人员能够在一次实验中以无偏倚、系统化的方式探究任何生物的整个基因组。

目前，CRISPR 筛选技术正被用于鉴定数百种人类癌症中的必需基因，并绘制遗传相互作用图谱。该技术还可全面分析药物，揭示药物的作用机制。本文所述的 CRISPR 文库靶向人类细胞。

然而，已有针对其他物种（如小鼠）的向导RNA文库可供使用，并可采用类似方法进行筛选。在人类细胞中开展全基因组筛选在实际操作中可能具有挑战性，因为该过程涉及数千万个细胞的处理，并需要对大量数据进行分析。在启动筛选实验之前，应确保细胞系已得到充分表征。

这包括了解细胞系的纯度、倍增时间、慢病毒转导效率以及对抗生素筛选试剂的敏感性。通过可视化演示，将展示在筛选过程中如何实际操作所需的数百万个细胞，并以系统化的方式跟踪数千个扰动。本实验操作将由我实验室的技术员 Andrea Habsid、Kamaldeep Aulakh 和 Ryan Climie 进行示范。

首先将预制的CRISPR sgRNA质粒转化至电转感受态细胞中，并按照文稿说明进行培养。当准备收集菌落时，向每个培养皿中加入7毫升含羧苄青霉素的LB培养基，用涂布棒刮下菌落。使用10毫升移液管将刮下的菌液转移至一个无菌的1升锥形瓶中，并用5毫升含羧苄青霉素的LB培养基冲洗培养皿。

再次将洗涤液转移至烧瓶中。根据手稿说明离心细胞，然后测定湿菌体沉淀的重量。使用大提或超大提质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA。

通过接种293 T细胞并过夜培养，为转染实验准备细胞。次日，为15厘米培养皿配制三种转染质粒混合物。计算单次转染所需的质粒用量，并为待转染的培养皿数量外加一个培养皿所需的质粒量配制混合液。

接下来，为每次转染制备基于脂质的转染试剂，并将减血清培养基分装至若干个1.5毫升微量离心管中，管数与待转染的培养板数量相同。加入转染试剂，轻轻混匀，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，按转染试剂与DNA质量比3:1的比例，将DNA加入转染试剂中形成DNA复合物。

轻轻混匀溶液，室温静置30分钟。将转染混合物加入包装细胞中，并根据文稿说明进行孵育。在病毒收获当天，观察细胞是否出现异常及融合形态，以判断病毒产生情况良好，并通过收集上清液转移至无菌离心管中来收获慢病毒。

首先选择在整个筛选过程中要维持的CRISPR向导RNA文库覆盖度。根据文库覆盖度，确定每条向导RNA所需维持的细胞数量，以及在感染复数（MOI）为0.3时所需的感染细胞数量。接下来，确定进行感染所需的培养板数量，然后将细胞收集并接种至每一块培养板中。

向所有培养板中加入六亚甲基溴化物，并向筛选板和对照二板中加入所需体积的病毒。对照一板中不加病毒，用培养基补足相应体积。

通过倾斜充分混匀平板，并将平板放入培养箱中，确保其水平放置。根据手稿说明收获感染的细胞，并从混合细胞中收集三份细胞沉淀用于基因组DNA提取。以500 × g离心5分钟，用PBS洗涤细胞。

标记试管，并将细胞沉淀在零下80摄氏度下进行冷冻干燥。将感染的细胞池分为三个重复组，确保每个重复组内保持文库覆盖度。以正常扩增细胞时常用的密度接种细胞。

每个重复组使用相同数量的细胞，并确保各重复组之间细胞总数一致。持续传代细胞，并从每批汇集的感染细胞中收集三份细胞沉淀重复样本，传代至多15到20次细胞倍增。每次传代时，将每个重复组内所有培养板中的细胞合并收集。

根据时间和重复编号标记每个沉淀物。按照文稿说明设置PCR1，每50微升反应体系中加入3.5微克基因组DNA，总共使用100微克基因组DNA，并建立相同的50微升反应体系以达到所需的测序深度。按照文稿说明设置一个PCR管反应。

使用5 µL混合后的PCR1产物作为模板，并为每个个体样本使用独特的索引引物组合，以便对测序文库样本进行混合。PCR完成后，将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以低电压电泳1至1.5小时。在蓝光透射仪上观察产物，并切下200 bp的条带。

使用分光光度计和荧光计纯化DNA并测定其浓度和质量。理想的向导RNA文库应确保每种向导RNA的含量相近。可采用高通量测序来验证文库中向导RNA分布的均一性。

精确率-召回率分析可用于评估筛选实验的性能。高性能的筛选实验应在基础因子大于六且错误发现率低于5%的情况下，回收大量必需基因。精确率-召回率曲线应具有明显的拐点，并以直线延伸至终点。贝叶斯因子表示基因敲除导致适合度缺陷的置信度量。

高分值表示置信度增加，而低分值表明基因敲除提供了生长优势。可通过在过量药物存在的条件下培养全基因组敲除文库，以寻找抑制性耐药基因。为进行胸腺嘧啶阻断抑制因子的阳性筛选，将T0时刻所有向导RNA的标准化读数计数与经胸腺嘧啶处理样本的均一化平均读数计数进行对比作图。

成功进行CRISPR筛选的一个关键细节是，从质粒转染到细胞转导的整个过程中，始终保持每种向导RNA的良好分布。这将最大限度地减少可能扭曲向导RNA代表性并导致假阳性或假阴性结果的随机效应。在完成筛选验证后，应进一步开展实验以确认筛选出的靶点，因为初筛仅能识别潜在的阳性靶点。

根据筛选结果所涉及的生物学特性，可采用多种方法进行后续研究。CRISPR基因编辑技术与下一代测序相结合，已在多种人类模型系统中实现了全基因组规模的功能缺失筛选。由于CRISPR技术操作简便，此类筛选方法现已广泛适用于各类研究人员，使更多科研人员能够利用功能基因组学方法来研究生物学过程及疾病机制。