利用用于捕获循环肿瘤细胞的医用导丝对肿瘤细胞进行表征：一种基于免疫荧光和DNA FISH的三维方法

本实验方案的总体目标是在三维功能化金属丝上结合免疫荧光染色与DNA荧光原位杂交技术，并利用常规的宽场荧光显微镜在载体上识别免疫表型及FISH信号。该方法有助于解答分泌性肿瘤细胞表征领域中的关键问题，例如识别循环中的非小细胞肺癌细胞中与治疗相关的靶点。本方案的主要优势在于能够同时鉴定表型参数（如EpCAM阳性）和胞核/胞质的遗传改变（如ARC基因状态），从而检测潜在的循环肿瘤细胞（CTCs）。

尽管该方法最初是为提供原位胰岛素瘤循环肿瘤细胞（CTC）特征而专门设计的，但也可应用于其他癌症的研究，如乳腺癌。我们在处理导丝用于直接免疫表型分析和CTC检测时开发了此方案。为了获得更全面的数据，我们将免疫表型分析方案与DNA荧光原位杂交（FISH）方案相结合。

操作该金属丝并不容易，主要是因为功能化的尖端较为脆弱。通过视觉演示，读者可准确重现操作步骤。开始实验时，用四毫升完全培养基将一个处于80%融合度的T75培养瓶中的全部内容物重悬于一个五毫升小瓶中。

接下来，将导线从其玻璃包装中取出。将导线上经过功能化的金质部分浸入小瓶中，确保导线塞子与5毫升小瓶之间密封严实。用实验室封口膜密封导线。

然后，将金属丝置于室温下，在试管旋转仪中孵育30分钟。旋转结束后，使用三个不同的洁净小瓶，用一倍浓度的PBS溶液将金属丝清洗三次，并等待金属丝干燥。在通风橱中将金属丝空气干燥10分钟后，将金属丝浸入5毫升试管中的100%丙酮溶液中，于室温下固定细胞10分钟。

确保功能化探针上无任何丙酮残留。在室温下将导线晾干五分钟。接着，在一个5 mL离心管中，用一倍浓度的PBS缓冲液清洗导线两次。

将金属丝孵育在抗体稀释缓冲液中。根据说明书中的要求，用荧光染料标记的单克隆一抗和抗体稀释缓冲液配制150微升的抗体混合液。然后，使用P200枪头从金属丝塞中取出金属丝，并轻轻将金属丝穿过枪头较大的孔。

先将未修饰的一端插入，并缓慢将导线穿过小孔，直至金质部分刚好穿过大孔。轻轻加入150 µL抗体混合液至尖端。为避免产生气泡，轻柔旋转导线，直至修饰端完全浸入。

封闭尖端的孔洞，并用实验室薄膜包裹孔洞处。将导线在4°C黑暗条件下垂直孵育过夜。第二天，用一倍浓度的PBS洗涤导线两次，以封闭抗体孵育步骤。

将金属丝重新插入其金属丝塞中。在进行DNA-FISH实验前3小时，将杂交炉温度设定为75摄氏度，并将干热烘箱温度设定为37摄氏度。将0.4倍浓度的SSC溶液冷却至4摄氏度。

用预冷的0.4倍SSC溶液将金属丝清洗三次。在通风橱内避光干燥10分钟。10分钟后，涡旋并离心探针5秒。

取10微升探针液滴入玻璃微量离心管中，然后用实验室封口膜覆盖。用干燥吸水纸包裹微量离心管。放入50毫升离心管中，短暂离心。

将干燥的金属丝小心放入微量离心管中，并插入金属丝塞。然后，用橡胶胶水密封金属丝塞。将该管置于杂交炉内的避光湿盒中，在 75 摄氏度下孵育 8 分钟，以实现 DNA 的完全变性。

八分钟后，将湿盒转移至37摄氏度的干热烘箱中过夜。将装有0.4倍SSC溶液的玻片染色缸放入设定为72摄氏度的水浴中。监测0.4倍SSC溶液的温度，直至其达到72±1摄氏度。

接下来，准备两个玻璃烧杯，一个装有两倍浓度的 SSC 加 0.05% Tween 溶液，另一个装有蒸馏水。将湿化室从干热烘箱中取出。

使用镊子小心地将橡胶胶水从导线塞中移除，并将导线未涂覆的一端穿过末端塞，注意不要损坏功能化尖端。将导线浸入0.4倍SSC溶液中，在72摄氏度下孵育2分钟。随后在2倍SSC加0.05% Tween溶液中室温洗涤30秒。

然后，用室温的蒸馏水清洗金属丝。在避光条件下，于通风橱中干燥金属丝10分钟。将金属丝的功能化尖端与预先配制的DAPI溶液在2毫升小瓶中孵育。

用一倍浓度的 PBS 将金属丝冲洗两次，并使其自然晾干。将金属丝置于金属丝固定装置中，小心地将功能化的一端穿过特殊固定装置的入口，直至尖端与耦合点对齐。将该特殊固定装置放置在显微镜载物台上。

使用20倍物镜调节显微镜的焦距。首先对特殊支撑结构进行粗调聚焦，然后在DAPI通道中呈现亮色的细胞上进行精细调节。仅对位于物镜视野中央的细胞进行聚焦，并使用12位数字相机，在20倍和40倍物镜下，结合红、绿、蓝探针的适当滤光片采集图像。

最后，将导线与功能化尖端并排放置并小心地插入玻璃管中，以准备长期保存。将导线在负20摄氏度下垂直或水平储存。免疫荧光染色未对DNA-FISH信号产生干扰。

在功能化三维支架导线上进行免疫-DNA-FISH 检测时，可清晰观察到 EpCam 染色。ALK 探针显示了基因缺失。NCI-H3122 细胞系表现出异常的 LAK 基因状态，而 NCI-H1975 细胞系则为 ALK 基因野生型。

掌握该方案后，可在三天内总共九个工作小时内完成。在操作过程中，应注意不要触碰导线的功能化部分，以防止造成任何损伤。根据本方案，可使用不同的抗体和FISH探针来回答其他问题，例如鉴定具有其他表型标志物的细胞，以及其他细胞遗传学改变，如NAT或HAR2基因扩增。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过表型参数（如 EpCAM 阳性）同时鉴定循环肿瘤细胞（CTC）的疑似细胞，并检测细胞遗传学改变（如 ARC 基因状态）。请注意，使用丙酮和烘箱时可能存在极高危险性。在进行该操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作丙酮，并佩戴防护手套。