人干细胞来源的回肠类肠体单层中M样细胞的诱导分化

由于M细胞在肠道中数量稀少，目前对M细胞在肠道稳态和免疫防御中所起作用的全面理解仍然不足。通过人肠道干细胞来源的培养物诱导M细胞分化，将有助于研究M细胞的发育过程及其功能。为包被Transwell膜，将所需数量的Transwell小室放入24孔板中，形成双室系统。

将细胞外基质（ECM）用冰冷的无菌磷酸盐缓冲液稀释25倍。然后，取100微升冰冷的稀释液加入每个上室的膜上。用盖子盖好24孔板，并将该板置于37°C的组织培养孵育箱中孵育2小时，以使ECM在膜上凝固。

两小时后，将培养板从培养箱中取出，放入组织培养超净台中。使用无菌镊子将每个Transwell小室倒置，轻轻去除残留液体。在收集细胞的同时，打开盖子，让膜在超净台中自然风干。

从培养箱中取出回肠类器官培养板，用真空抽吸或移液器轻轻吸除每个孔中的培养基。为消化细胞外基质（ECM），向含有悬浮于ECM中的回肠类器官的每孔加入500微升冰上预冷的0.5毫摩尔EDTA。使用设置为500微升的P1000移液器反复剧烈吹打，以充分破碎ECM，从而将回肠类器官释放到溶液中。

将每个孔中的溶液收集到15毫升锥形管中。在140 × g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。沉淀应可见，但容易松动，因此需缓慢通过真空抽吸或移液器吸除上清液。

为了消化紧密连接并使回肠类器官解离成单个细胞，每收集五个孔的类器官，用500微升室温胰蛋白酶重悬沉淀。使用P1000移液器反复吹打以分散细胞团块。将离心管置于37°C水浴中孵育五分钟或更短时间。

每 500 微升胰蛋白酶中加入 1 毫升含 10% FPS 的高级 DMEM F-12 培养基以灭活胰蛋白酶。使用设置为 500 微升的 P1000 移液器，在锥形管壁反复吹打至少 50 次，进一步将残留的细胞团块解离为单细胞。将 40 微米细胞筛置于 50 毫升锥形管上，并加入 1 毫升含 10% FPS 的高级 DMEM F-12 培养基润湿细胞筛。

将15毫升锥形管中的单细胞悬液用移液器转移至滤筛上。用1毫升含10% FPS的改良DMEM/F-12培养基冲洗滤筛。将滤筛后流入50毫升锥形管中的细胞转移至新的15毫升锥形管中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞在新的15毫升离心管中以400×g离心5分钟，室温条件下进行。应可见细胞沉淀。

用移液器小心吸去上清液，再次将上清液保留，以防沉淀物脱落。将细胞沉淀重悬于含10微摩尔Y27632的MCMGF培养基中。确保ECM编码的膜已通过肉眼观察确认完全干燥。

用200微升MCMGF plus洗涤上室，然后向每个上室中加入200微升细胞悬液。向每个下室中加入700微升含有10微摩尔Y27632的MCMGF plus。

将培养板置于37摄氏度、含5% CO2的组织培养箱中。培养一天后，移除上室中的培养基，并替换为200微升新鲜的MCMGF plus培养基，以防止多层细胞生长。当单层细胞融合度达到约80%时（通常在接种后第1至第3天），将对照孔的基底侧培养基更换为分化培养基，将M细胞诱导孔的基底侧培养基更换为M细胞诱导培养基。

在两种条件下，将上室中的培养基更换为分化培养基。为通过定量逆转录PCR验证M细胞的分化，首先移除上室和下室中的培养基，然后用300微升室温的磷酸盐缓冲液（PPS）轻轻清洗上室两次。

向每个上室加入 300 微升 TRIzol，在室温下孵育五分钟。同时，为每个孔标记微量离心管，并向每管中加入 700 微升 TRIzol。用 P1000 轻轻吹打细胞匀浆液上下混合三次，收集细胞匀浆液，并转移至对应的微量离心管中。

涡旋混匀五秒钟。将样品在室温下静置三分钟，然后继续进行标准的qRT-PCR实验操作，或在-80°C条件下保存样品。为通过免疫荧光验证M细胞的分化，首先从上室中移除培养基。

用 300 微升室温 PBS 轻柔洗涤两次。向顶室加入 100 微升室温下含 4% PFA 的 PBS。用铝箔覆盖培养板，在室温下静置 25 分钟。

去除PFA后，用300微升室温PBS洗涤上室三次。在室温避光条件下，将单层细胞与100微升溶于PBS的5% BSA溶液孵育30分钟，以封闭单层细胞，随后去除溶液。用含1% BSA的PBS配制GP2一抗溶液，稀释比例为1:100，每孔加入100微升。

室温避光染色一小时，然后移除溶液。用 300 微升室温 PBS 将上室清洗三次。配制含荧光标记的山羊抗小鼠 IgG、鬼笔环肽和 DAPI 的二抗染色液，每孔加入 100 微升。

在室温避光条件下染色30分钟。用300微升PBS洗涤孔板三次。然后，在玻璃载片上滴加5微升封片液。

从24孔板中取出小室并倒置。在将膜从Transwell中取出时，必须保持膜完全平整。膜上的凸起会导致其与玻片之间无法形成牢固的密封，从而严重影响成像质量。

为确保成功，使用锋利的手术刀小心地将膜从培养小室中切割下来。将带有细胞的一面朝上放置于载玻片上的封片液滴中。在膜的顶部中央加入10微升封片液，然后盖上盖玻片，使膜密封在载玻片与盖玻片之间。

将载玻片在室温避光条件下干燥 24 小时。通过免疫荧光法检测 M 细胞表面 GP2 的表达来鉴定 M 细胞。通常，在接种后第六至第八天，经 RANKL 和 TNF-α 处理的样本中，于 40 倍显微镜下观察融合单层时，每个视野可观察到 1 至 5 个 M 细胞。

在未处理的样本中未见 GP2 表达。XZ 平面的正交视图与鬼笔环肽探针叠加显示了围绕每个细胞的肌动蛋白结构，以及 M 细胞顶膜表面的 GP2 表达。该模型重现了人类肠道中 M 细胞低频出现的特征。

为了确定在此模型中发育的M细胞是否能够与IgA结合，使用识别人血清IgA重链的荧光标记二抗对M细胞上的IgA进行可视化检测。经IgA处理一小时的M细胞，其顶膜表面可见IgA结合；而仅用抗IgA二抗处理的对照孔中的M细胞则未检测到信号。此外，IgA特异性结合于M细胞的顶膜表面，而在任何缺乏GP2表面染色的细胞上均未发现结合。

此外，M细胞在其顶面具有特征性的较短且密集的肌动蛋白。当单层细胞融合度达到约80%时，转换为添加RANKL和TNF-α的分化培养基，是实现良好M细胞分化的关键。该技术将使研究人员能够探索与M细胞发育相关的问题，以及涉及M细胞的宿主-病原体相互作用和药物转运研究。