用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

单克隆抗体主导着生物制药市场，通常通过蛋白A亲和层析进行纯化。相应的层析树脂在生产过程中是主要的成本驱动因素，影响着抗体类治疗药物的价格。本文介绍了一种基于荧光蛋白的新型亲和配体，该蛋白可作为HIV中和抗体2F5线性表位的载体。

总体而言，我们的方法能够快速制备可用于单克隆抗体捕获的亲和层析树脂。我们通过从粗制植物提取物中捕获抗体 2F5 验证了该方法的能力。为提高动态结合载量和树脂的可重复使用性，我们对捕获条件和溶液缓冲液进行了优化。

我们的树脂通常比蛋白A具有更宽松的条件，有望降低单克隆抗体的纯化成本。此外，该树脂可轻松适配于其他结合线性表位的抗体。开始此操作前，调整已制备的亲和配体溶液浓度，使其处于实验设计所规定的每升5至15克范围内。

将溶液置于冰上保存，直至准备进行偶联反应。接下来，用一个两毫升注射器吸取DFE溶液，并准备一个连接适配器，用于将注射器安装在床体积为一毫升的NHS活化交联琼脂糖柱上。

每使用10个柱子进行偶联，需准备30毫升失活溶液、30毫升低pH溶液和1毫升保存溶液。然后在离心管中准备20毫升1毫摩尔盐酸，并在冰上孵育至少20分钟。

准备一台精密天平，用于监测偶联反应过程中所有步骤的流穿组分。随后，打开一支密封的NHS活化交联琼脂糖柱。在接头入口处加入一滴缓冲液，以防止空气进入柱中。

将注射器接头安装到色谱柱入口。以低于每分钟1毫升的流速，用6毫升冰浴的1毫摩尔盐酸冲洗色谱柱。使用2毫升注射器，立即以低于每分钟1毫升的流速注入1.5毫升DFE溶液。

并在精密天平上收集穿流组分，用于后续分析。将层析柱两端密封，在22摄氏度下孵育15至45分钟。随后以低于每分钟1毫升的流速，依次注入6毫升活化溶液和6毫升低pH溶液，以去除树脂上非共价结合的配体。

注入6 mL活化溶液，并将层析柱孵育15分钟。随后，向层析柱中注入6 mL低pH溶液，接着再注入6 mL活化溶液。

然后向柱中注入另外6 mL低pH溶液。向柱中注入2 mL保存溶液，并在4°C下保存。首先制备100 mL含有2F5的澄清植物提取物，或制备优选的基于细胞表达系统的上清液（同样含有2F5）。

接下来，按照文本方案配制平衡缓冲液和高铁X倍强度illusion缓冲液。用这些缓冲液冲洗层析系统。将DFE亲和柱安装到层析系统上。

然后用五个柱体积的平衡缓冲液以每分钟1毫升的流速进行平衡。监测280纳米处的紫外吸光度。接着以每分钟5毫升的流速将80毫升澄清的植物提取物或上清液上样到柱中。

确保接触时间为两分钟。以2毫升为一份收集流出液样品，用于穿透曲线重建。若无法立即进行样品分析，则将流出液样品储存在4°C条件下。

用6个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。在洗涤的开始、中间和结束时分别收集样品。用五倍体积的高离子强度稀释缓冲液稀释MAB2F5。

当280纳米处的紫外信号较基线升高5毫吸光度单位时，收集DFE组分。根据文本方案中所述，针对每种表位-抗体组合优化洗脱缓冲液。融合蛋白DFE在转基因烟草植株中表达，并于温室中培养。

DFE 的总回收率为 23.5 毫克每千克。纯度超过 90%。固定在树脂上的 DFE 绝对量随着注入柱中 DFE 质量的增加而增加，并在约 15 克每升时达到 plateau（平台期），而偶联产率则随着注入更多 DFE 而持续下降。即使在偶联后，DFE 分子仍显示出其红色荧光。

颜色深浅对应于固定化 DFE 的总量。因此，可通过色谱柱颜色作为简单的质量控制参数，以评估偶联效率和色谱柱质量。重组 2F5 抗体在植物生长箱中培养的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）植株中瞬时表达产生。

使用偶联了约七毫克纯化DFE的亲和柱，检测从粗制植物提取物中捕获2F5的效果。1.25摩尔的氯化镁浓度足以从DFE亲和树脂中洗脱2F5，回收率接近100%，纯度约为97%，与Protein A树脂相当。在25个循环过程中，DFE亲和树脂在2F5穿透10%时的动态载量（DBC）呈线性下降，降至初始值的约15%。

我们采用实验设计方法优化了亲和配体的偶联能力。这些条件今后可针对其他配体进行精细调整。我们的方法利用荧光蛋白作为载体，穿插连接产物特异性配体的亚单位蛋白。

同时，将功能作为动员过程的视觉质量指标，为操作者提供即时且直观的反馈。