一种用于体外评估细胞力传感与硬度趋向性的简化系统 In Vitro

本实验的总体目标是提供一个简化的系统，用于分析细胞 durotaxis（细胞倾向于向更坚硬基质迁移的现象）。首先制备具有特定硬度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基质，然后将制备好的 PDMS 倒入六孔板的每个孔中，并去除所有气泡。

然后通过在每个孔中的 PDMS 上方放置无菌盖玻片来完成 Durex 小室的组装，形成覆盖层。最后一步是将细胞以适当的密度接种到 Duro taxes 小室中，使细胞有足够的空间迁移，而不会与其他细胞发生显著相互作用。最终利用活细胞显微镜观察迁移细胞中的轴突。

与现有的聚丙烯酰胺等方法相比，该技术的主要优势在于软质PDMS与刚性玻璃之间仅需一步连接，而无需使用梯度凝胶替代方案。此外，用纤连蛋白等细胞外基质成分包被PDMS时，无需化学交联，而聚丙烯酰胺凝胶则需要此步骤。准备一块六孔组织培养板时，首先用50毫升锥形管撕开平衡。

在50毫升离心管中称取约10克聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础溶液。对于90:1的基质比例，将测得的PDMS基础溶液质量除以90。为确定所需交联剂溶液的准确用量，将计算量的PDMS交联剂溶液加入管中，于室温下剧烈混合PDMS基础液与交联剂的混合物5分钟。

在此阶段使用小刮刀，混合物中会含有少量气泡。将PDMS基底放入台式离心机中，以50 × g离心5分钟。如果仍有气泡，可在室温下静置以去除气泡。

五分钟后再次离心，用移液器将一毫升90比1的PDMS基底转移至经组织培养处理的六孔板的每个孔中。此时可通过21号针头刺破的方式去除PDMS中残留的任何气泡。

让PDMS在孔中扩散30分钟。随后将12毫米直径、厚度为一号的玻璃盖玻片在蒸馏水中煮沸5分钟，共重复三次。用镊子轻轻接触盖玻片一侧，将一片干燥的盖玻片放入组织培养板的每个孔中。

将盖玻片插入PDMS溶液中，然后将盖玻片轻轻放入PDMS中。当盖玻片沉降时，PDMS将开始逐渐覆盖盖玻片的边缘，但不会完全覆盖。固化后，PDMS与玻璃之间将形成一个界面。

将培养板置于70摄氏度的烘箱中孵育16小时，以固化PDMS。最后，将培养板放入细胞培养操作台中，进行10分钟的紫外灭菌。每个硬度计培养室用1毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液中的纤连蛋白在30摄氏度下孵育1小时进行包被。

确保整个表面浸没在 PBS 中的纤连蛋白溶液中。通过称取 0.5 克牛血清白蛋白（BSA）并将其溶解于 50 毫升 PBS 滤液中，制备热变性的 1% 牛血清白蛋白（BSA）。经 0.22 微米滤膜过滤除菌后，在 80 摄氏度加热 12 分钟。

接下来，吸除纤连蛋白溶液，并用 PBS 洗涤小室三次。每孔加入 1 毫升含热变性 BSA 的 PBS，室温孵育 30 分钟，同时对细胞进行胰蛋白酶消化，并计数所选细胞，此时 Durex 小室正用热变性 BSA 进行封闭。在接种细胞前，立即从各小室中吸除热变性 BSA 溶液。

将10,000个细胞以2毫升体积接种至doax培养室的每个孔中。使用所选细胞类型所需的培养基，在37°C、5%CO2的湿润培养箱中孵育4小时，使细胞在基质上贴壁并铺展。随后，在倒置显微镜下使用10倍物镜和相差显微技术进行活细胞成像。显微镜应配备封闭式湿润环境培养室，以便在长时间成像过程中维持37°C的温度和5%CO2的气体条件。

细胞铺展约3.5小时后进行成像，将培养板组装至显微镜载物台腔室中。让样品在腔室内平衡30分钟。如有条件，设置显微镜的自动多点采集程序。

重点关注PDMS与玻璃盖玻片之间的界面，并选择围绕该界面的多个成像点。每个Durex腔室平均成像约40个点，每隔10分钟对细胞成像一次，持续长达16小时。感兴趣区域将呈现为两条线，外侧线对应盖玻片的边缘，内侧线对应PDMS与盖玻片之间的实际界面。为分析数据，请生成一个类似于文本方案中所示的电子表格。

统计每段生成视频中细胞核从PDMS表面穿过到玻璃表面以及反向穿过的次数。穿行事件定义为细胞核从任一方向越过PDMS与玻璃之间的边界。将穿行事件的次数记录在Excel电子表格的相应列中，以量化多次穿行情况。

统计细胞穿过界面的次数。该数值应记录在Excel表格中与细胞在视频结束时所在底物相对应的列中。对视频中每一个穿过界面的细胞重复进行分析。

在成像过程中，排除迁移到视野之外的细胞。计算从PDMS迁移至玻璃表面、因而经历Duro Texas的细胞所占的百分比。为此。

将从软基质到硬基质的跨越事件次数，以及最终停留在硬基质上的多次跨越事件次数相加，再除以总的跨越事件次数。通过将多次跨越事件的总数除以总的跨越事件数，计算多次跨越所占的百分比，以初步理解细胞响应其环境中力学信号的分子机制。如图所示，可利用RNA干扰（IRNA）技术敲低特定蛋白质。

大约70%的对照组（irna处理）细胞表现出轴突延伸。相比之下，当使用RNAi敲低CD gap时，细胞对迁移到较硬或较软基质上没有明显偏好。此外，CD gap敲低的细胞多次跨越边界。

对照组irna处理的细胞通常仅穿过边界一次，其代表性轨迹显示，这些细胞穿过边界后倾向于停留在较坚硬的表面上；而CD gap irna处理的细胞则未表现出对任一硬度表面的偏好，并多次穿过边界。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备 PDMS 基底、组装 duris 腔室以及定量分析 DUR 应力。