利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

细胞边缘突出实验已被证明与细胞迁移直接相关，因此可作为鉴定参与细胞运动的关键蛋白和信号转导机制的初步方法。该方法快速、简便、成本低廉，且无需荧光标记或使用昂贵的荧光显微镜。

演示该实验步骤的是我实验室的学生 Michal Gendler。在玻璃底培养皿中央加入 2 mL 的 1 N 盐酸溶液，在室温下孵育 20 分钟。用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿三次。

将纤连蛋白用 PBS 稀释至 10 微克/毫升的浓度，取 200 微升稀释液加入玻璃中心培养皿中。在 37 摄氏度孵育 1 小时。配制 1% BSA 溶液和 PBS，并通过 0.2 微米滤器过滤。

将溶液置于预热至70摄氏度的水浴中孵育30分钟以使其变性。用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗包被的玻璃底培养皿，重复三次。加入两毫升变性的牛血清白蛋白（BSA）溶液，并在37摄氏度孵育培养皿一小时。

用 2 毫升 PBS 将玻璃培养皿清洗三次。在实验前 16 至 18 小时，以每 10 厘米直径组织培养皿接种 70 万个细胞，使其达到 70% 至 80% 的融合度。次日，向组织培养皿中加入 2 毫升胰蛋白酶溶液，孵育 2 至 3 分钟，直至细胞脱落。

加入 5 mL 培养基以灭活胰蛋白酶。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将 20,000 个细胞接种于 2 mL 完全培养基中，置于底部培养皿内。随后将接种有细胞的培养皿放入培养箱中孵育 15 分钟。

在成像前一小时打开加热装置，并将其设置为37摄氏度。在成像前十分钟打开二氧化碳装置，并将其设置为5%。开启显微镜和相机。

打开计算机并启动显微镜采集软件。将物镜设置为40倍干镜相位差模式。将总录像时长设为10分钟，时间间隔设为5秒。

孵育15分钟后，将带有贴壁细胞的玻璃底培养皿放入适配器中并固定。将装有培养皿的适配器插入显微镜载物台的插槽中。取下培养皿盖，盖上二氧化碳盖，并打开二氧化碳阀门。

找到一个适合成像的细胞。在对细胞聚焦后开始录制视频。进行图像分析时，在图像分析软件中选择直线工具，以45度为间隔，在细胞突起的径向方向上垂直绘制八条长度为20个任意单位的直线，覆盖片状伪足和细胞边缘。

在主工具栏中，进入图像菜单，选择“栈”（Stacks），然后点击“重新切片”（Reslice）以生成描述细胞膜内单个点运动的线扫图像（kymograph）。利用线扫图像，在由网格线标记的细胞八个区域中，分别提取并手动统计每个区域的凸起、回缩和皱褶的数量。这些数值代表每10分钟内凸起、回缩和皱褶的发生频率。

通过线扫分析（kymography analysis）确定突起的持续性、距离和速度。为测定突起距离，从突起的基部向其最高点绘制一条垂直线。按 M 键测量该线的像素长度，并确保已知像素与微米之间的比例关系，以便将长度转换为微米。

每10分钟手动量化一次突起、回缩和皱褶的频率，得到突起和回缩的平均频率分别为5.1和2.1，皱褶的平均频率为2.1。代表性显微图像显示突起距离约为4.8微米，突起持续时间约为0.6分钟。图中展示了一个应从分析中排除的细胞示例。

显微延时成像分析显示，该细胞未处于铺展阶段，且未表现出任何明显的膜突起。最重要的是选择适合成像的细胞。合适的细胞应处于铺展阶段，且不应与其他细胞接触，以避免细胞间通讯和信号传导。

该方法可作为初步工具，用于在决定开展对结果要求更高的细胞迁移实验之前，检测涉及细胞运动性的细胞骨架动态变化。