利用激光显微切割技术从小鼠脊髓运动神经元胞体中制备转录组分析用RNA

本实验的总体目标是从脊髓运动神经元中回收高质量 RNA，同时避免邻近细胞 RNA 的污染。首先，将脊髓组织取出、分割并包埋于冷冻包埋介质中，在负 160 摄氏度条件下冷冻。第二步是在负 20 摄氏度条件下，将脊髓组织冷冻切片至带有膜的 PEN 膜片上。

接下来，将切片用70%乙醇洗涤，并用70%乙醇中的亚甲蓝B染色。最后一步是将已识别的运动神经元胞体通过激光显微切割技术分离至硫氰酸胍裂解缓冲液中。最终，从合并的裂解液中提取总RNA，并进行检测，以揭示突变型与野生型动物神经元中总体或特定RNA转录的差异。

激光捕获显微切割技术可从脊髓切片中分离出运动神经元胞体，避免被数量更多的施瓦茨曼细胞及其他细胞类型污染，从而有机会制备RNA，并比较来自患病动物与正常动物的神经元之间的转录差异。在建立该实验流程中最困难的部分是寻找一种染色方法，使其既能让我们在脊髓切片中识别运动神经元，又能在激光捕获前后以及捕获过程中保持高水平的RNA完整性和可提取性。

我们发现，将切片用亚甲蓝（Azure B）和70%乙醇染色，并结合直接将分离的细胞体收集到硫氰酸胍裂解缓冲液中的方法，符合这些标准，从而证明了该程序的有效性。Van Padia（我们实验室的博士后）展示了这一操作流程。为获得最佳结果，在动物安乐死后及经心灌注后，务必用RNase去污染溶液清洁所有器械，随后再用无RNase的70%乙醇冲洗。仔细分离脊髓组织，将脊髓在无RNase环境中用缓冲液冲洗10秒。

用无菌水冲洗以去除残留血液，并迅速而轻柔地将其放置在无RNA酶的玻璃载片上。接着，使用洁净的剃须刀片将脊髓横向切成9到10段。将切段放入盛有OCT包埋剂的冷冻模具中，并用洁净的针头将其垂直排列整齐。

将模具放入一个装有经液氮预冷的甲基丁烷的浅盘中。为防止RNA降解，将浅盘置于液氮浴中，以快速冷冻脊髓组织块。

将包埋于OCT中的组织块在负80摄氏度下保存，可存放长达六个月，之后进行切片。准备切片时，将OCT包埋的组织块置于预冷的冷冻切片机中。每片切取20微米厚度，每片包含9至10个脊髓横切面。

将切片置于无RNAs的笔膜上。先将2微米厚的载玻片置于室温下，以确保切片贴附牢固。随后立即将切片在冷冻切片机内负20摄氏度的表面上重新快速冷冻。

将载玻片置于负80摄氏度保存，使用前放置于洁净的架位上。准备六个50毫升的无RNA酶的锥形管，每管中加入70%乙醇，液面深度应足以覆盖载玻片上所有组织切片在浸入时的需求。

接下来将1% Azure B溶液置于同一染色架上。为尽量缩短更换洗涤或染色溶液所需的时间，可在染色架前方放置三到四张实验室擦拭纸，以便快速沥去多余溶液。准备就绪后，将载玻片从-80摄氏度的低温冰箱中取出，放置于干冰上，通过将单张载玻片置于戴手套的手掌上使其缓慢解冻。

用实验室擦拭纸小心擦拭载玻片，去除大部分水分和冷凝水，注意不要触碰组织切片。将载玻片置于培养皿中的新鲜硅胶干燥剂上，干燥 30 至 40 秒。干燥后，将载玻片浸入第一个装有无 RNase 的 70% 乙醇的试管中。

将切片浸泡30秒，然后通过在溶液中上下浸入45秒至1分钟以洗去OCT。接着将切片从溶液中取出，在实验室擦拭纸上沥去多余的液体。重复此过程，将切片浸入第二个装有70%乙醇的试管中。

如果 OCT 包埋剂仍残留在脊髓切片周围，请在第三个管中重复洗涤步骤。沥干多余液体后，将载玻片浸入含有 70% 无 RNA 酶乙醇的 1% 焦宁 B 溶液中，染色 30 至 45 秒。用实验室擦拭纸沥去多余的焦宁 B 溶液。

此时，整个切片将呈现蓝色。将切片浸入下一个装有70%乙醇的试管中，快速上下移动三到四次，以去除多余的染料，并使特异性的运动神经元染色显现。如果切片染色过深，可在新的70%乙醇试管中重复脱色步骤。

如果染色过浅，可将切片再次放入Azure B溶液中染色32秒，并重复脱色步骤。若染色效果满意，则让切片短暂空气干燥，随后进行下一步操作。经DES染色并干燥后，灰质呈浅蓝色，而深蓝色的运动神经元将清晰可见。

打开显微镜后立即开始解剖。卸下管架，安装一个0.6毫米微量离心管的管盖。用于样品采集时，将30微升胍和硫氰酸盐裂解缓冲液加入管盖中，并通过分散溶液覆盖整个表面。

使用移液器吸头，将帽盖与孔洞及物镜对齐。在显微镜软件操作过程中，保持帽盖处于覆盖位置，直至开始激光捕获。将空气干燥的载玻片倒置于显微镜载物台上，使膜面朝下，切片与孔洞对齐。

将切片放置到位后，先用5倍物镜对准脊髓切片区域，然后切换至20倍物镜进行显微切割。首先，使用光笔标记一个虚拟区域，并让激光将其切割但不收集，以释放膜张力，从而能够连续标记并切割多个区域。

接下来，重新对焦并识别腹角区域的运动神经元。这些神经元可通过其位于腹角的位置、典型的形态、较大的体积以及经亚甲蓝染色后呈现深蓝色来辨认。使用光笔选择绘图工具，沿运动神经元边缘进行描记，形成完整的轮廓。应尽量使轮廓紧贴运动神经元，以避免其他细胞的污染。

可在切割前标记多个细胞，因为软件会记住标记位置，待准备切割时，将管盖移至切割位置下方，点击启动按钮，即可用激光开始分离运动神经元。将所有切片上的运动神经元全部收集到一个载玻片上的同一根微量离心管管盖中。收集完成后，通过卸下托盘取出微量离心管，并轻轻取出管子，通过上下吹打溶液，使运动神经元和缓冲液完全溶解。

染色后立即将样品置于干冰中速冻，然后在离心机中离心，使溶液移入试管底部，并在负80摄氏度下保存。运动神经元表现为大而深染的细胞体，可通过抗CHATT抗体染色确认，并可轻松与周围较小的邻近细胞区分开来。在此示例中，运动神经元的细胞体已由软件使用光笔勾画出轮廓并编号。

此处，细胞体已被激光切割并落入收集管中，同时轮廓线已关闭。邻近区域受到的激光损伤程度清晰可见。图中显示的是通过激光显微切割（LMD）收集的大约4,000个小鼠运动神经元细胞体样本的RNA完整性电泳分析典型结果。

注意明显的核糖体 RNA 峰。从切片染色到运动神经元显微切割的整个过程，应在一个载玻片上所有切片的 30 分钟内完成，以最大限度地减少 RNA 降解。在进行该操作时，必须牢记在脊髓的初始解剖与包埋过程中，以及在运动神经元染色和激光显微切割的最后步骤中，都应尽可能快速操作。