小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

在此，我们展示了小鼠肝窦内皮细胞（LSECs）原代分离的实验方案。该方案包括肝脏胶原酶灌注、低速超速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选。我们的LSEC分离方法效率高，适用于健康及病变的小鼠肝脏。

分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs）纯度高，并能保持其结构和功能。采用本方案分离的LSECs适用于功能研究、分子研究以及多组学数据的生成。该方案将有助于肝脏内细胞间通讯的研究。

首先，用3毫升胶原蛋白溶液包被10厘米的培养皿。然后，在室温下孵育培养皿1小时。1小时后，移除包被表面的多余液体。

用 PBS 清洗培养皿三次，并使其自然风干。设置加热且加湿的循环灌注装置。使用 10% 次氯酸钠溶液冲洗灌注系统五分钟。

然后，再用无菌水冲洗系统10分钟。在用胶原酶溶液灌注前，尽可能排干冲洗液。通过灌注系统注入胶原酶溶液，并预热至37摄氏度。

将泵速调节至速度控制旋钮上的“1”档。在整个操作过程中保持速度不变。称量小鼠的体重以进行操作。

然后将其固定在手术台面上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪，从腹部下端开始向上至剑突处，做一个约五厘米长的切口。

随后，使用小型虹膜剪在腹部两侧各做两个侧向切口，以充分暴露腹腔器官。将静脉留置针的套管鞘置于动物背部下方，以抬高并拉平腹部。用普通的弯头敷料镊子，轻轻地将肠管和胃向动物左侧拨开。

然后，在暴露的左肾下方的下腔静脉（IVC）下方放置一根5-0外科缝线。将缝线打一个松散的结。接下来，在肝门静脉周围放置另一根5-0外科缝线。

将缝线置于肠系膜上静脉与门静脉汇合点稍上方，再次在缝线上打一个松散的结。利用门静脉缝线施加张力，将20号静脉留置针插入肝门静脉，进针位置位于门静脉分为左右肝支以下1厘米处。

然后，将导管沿静脉向上推进，但需保持在分支区域下方。让血液沿导管向下流动，直至开始滴出。使用门静脉缝线固定静脉导管。

使用静脉输液管将装有缓冲液A的输液瓶连接到导管上。然后用该溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。在肾脏下方结扎下腔静脉周围的缝线。

随后，剪断结扎线以下的下腔静脉，使动物排血。开始灌注后，切除与肝脏相连的胃、肠、脾脏及其他内脏器官。然后，剪除胸腔内的膈肌和主要血管。

将肝脏从动物体内取出并放置在灌注托盘上。小心移除静脉输液管，并将循环腔室中的胶原酶溶液连接上。持续灌注肝脏，直至其包膜变软并呈现松软状态。

此过程通常需要 10 到 15 分钟。消化完成后，将肝脏从消化腔中取出，置于含有约 20 毫升无血清 DMEM 的 10 厘米培养皿中。用几支移液器吸头轻轻将肝脏组织撕解，弃去胆管树组织。

随后，将肝脏悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。在室温下以50 × g离心细胞悬液2分钟。然后，收集含有非实质肝细胞的上清液。

在4°C条件下，以300 × g离心上清液5分钟。随后，收集细胞沉淀，并将其重悬于1 mL分离缓冲液中。按照制造商说明书，使用自动细胞计数仪测定细胞数量。

接下来，离心细胞悬液。完全吸除上清液，并按每1000万个细胞加入90微升分离缓冲液的比例重悬细胞沉淀。按每1000万个总细胞加入10微升CD146 MicroBeads。

充分混匀，并在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。洗涤细胞时，每 1000 万细胞加入 1 至 2 毫升分离缓冲液。在 300 ×g 条件下离心 10 分钟。

随后，彻底吸除上清液，并将最多十亿个细胞重悬于500微升分离缓冲液中。接下来，用3毫升分离缓冲液冲洗分离柱以进行准备。将细胞悬液加入装有70微米预分离滤器的分离柱中。

用三毫升分离缓冲液洗涤层析柱三次。随后，将层析柱从分离装置上取下，置于一个15毫升离心管上。用移液器将五毫升分离缓冲液加到层析柱上。

为回收磁珠标记的细胞，需用力将柱塞推入色谱柱以冲洗出细胞。最后，在4°C条件下以300 × g离心5分钟。采用流式细胞术检测分离所得LSECs的纯度及表面标志物。

基于前向散射和侧向散射数据，对门控的肝窦内皮细胞（LSECs）和单细胞进行数据分析和设门策略。分离的LSECs使用活力染料以及CD45、CD146和Stabilin-2抗体组合进行染色。通过CD45阴性群体圈选活的LSECs，并分析其CD146和Stabilin-2的表达情况。

根据这些数据，确认分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs）活力超过94%，纯度超过90%。通过光学显微镜和扫描电子显微镜进一步验证了分离细胞的LSEC特异性表型。分离的LSECs在完全培养基中培养6小时后，进行光学显微镜观察。

扫描电镜图像中的白色箭头指示肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构，这是LSEC的典型形态学特征。确保肝脏组织完全灌注的关键步骤包括：正确固定导管胶带位置、避免将空气引入导管，以及胶原酶消化的最佳时机。采用本方案获得的高质量LSEC将有助于阐明LSEC功能的分子机制，并增进我们对LSEC在肝脏生理与疾病状态下细胞间通讯作用的理解。