利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

我们优化了一种IBEX工作流程，该流程结合肝素封闭与光谱检测，以抑制富含嗜酸性粒细胞的人体组织中的背景信号。自发荧光和嗜酸性粒细胞颗粒结合会掩盖真实信号。我们同时针对这两方面进行处理，以实现清晰的高重标记成像。

首先，使用防蜡笔（pap pen）在载玻片上围绕固定好的组织画一个圆，以形成疏水屏障。向每份组织中加入约 100 µL 的 PBS，使其重新水化，并在室温下孵育约 2 分钟，以洗去包埋用的最佳切割温度化合物（optimal cutting temperature compound）。使用吸液玻璃巴斯德吸管从组织周围吸除 PBS。

然后向每份组织中加入 100 µL 封闭缓冲液，在湿盒中室温孵育 1 小时。现在用移液器吸除封闭缓冲液。向每份组织中加入 100 µL 染色混合液，将玻片置于加盖的湿盒中，在 4 °C 冰箱内过夜孵育。

同样，制备仅用一种荧光染料染色的切片以及未加任何染料的阴性对照，以确定荧光染料的光谱和组织自发荧光。吸除染色液后，用 PBS 洗涤组织三次，每次洗涤后均吸除液体。将样本置于显微镜载物台上进行成像。

使用明场或微分干涉差（DIC）模式对样品进行聚焦。然后切换至荧光模式，并根据实验需求设置光谱采集参数。为实验中使用的荧光染料选择合适的激光器。

选择与所选激光谱线相对应的分光器。启用所有探测器以捕获完整的发射光谱，并将图像采集分辨率调整为预设分辨率之一，或选择最高分辨率。

将针孔大小调整为一个面积单位，以获得最佳的光学切片效果。在采集前优化激光设置。使用一张经所有标记物染色的切片，以低激光功率开始连续扫描模式。

调节每个检测器的主增益以及激光强度，直至所有标记物均能以良好的信号与背景比被识别。精细调整激光强度，并在单染和多染切片之间反复交替优化，直至所有荧光信号均可见且无过饱和现象。在采集软件中启用拼图功能，并围绕组织定义拼图采集区域，以确保完整的图像覆盖。

在组织中心区域优化切片采集区域的焦距。识别一个独特的结构特征，例如一组排列清晰可辨的细胞，作为后续成像轮次中对齐的参考依据。现在启用Z轴层叠成像（Z-stack）功能，并切换到Z轴层叠成像选项卡。

在中心选项卡下，将切片数量设置为至少六个，切片之间的间隔不少于一微米。单击中心按钮，将上一步确定的当前焦点位置设为图像堆栈的中间切片。单击开始实验按钮以启动图像采集。

采集完成后，右键单击图像缩略图，选择“另存为”，选择文件保存位置并命名图像。将图像数据备份至安全存储设备中。使用在拼接区域采集期间所应用的相同优化设置对图像进行解混。

拍摄每份单染对照样本的图像，以获取真实的信号光谱，同时拍摄未染色对照样本的图像，以获取背景信号或自发荧光。仅将这些图像用于光谱拆分。通过检查未染色对照中信号强度和形态是否缺失或与背景水平相当，并确认标记物的定位符合其预期的细胞分布模式（如膜定位、核定位、胞质定位或分泌性分布），来验证所选区域代表真实的信号。

在软件中打开快照图像。点击解混选项卡，选择解混工具选项卡下的其中一个区域选择工具，在阳性信号周围绘制感兴趣区域（ROI），以生成该区域的光谱。将每个生成的光谱与相应荧光染料的理论发射光谱进行比较。

确保该区域准确代表真实信号。根据荧光染料的种类为每个光谱命名，并将其保存至光谱数据库中。接下来，加载拼接图像并打开光谱分离工具。

使用加号按钮将每种荧光染料的参考光谱添加到解混列表中。点击线性解混按钮以分离光谱信号，并保存解混后的图像。在通风橱中配制漂白溶液。

使用微型刮勺，将10毫克硼氢化锂直接称量至一个干燥的烧杯中。小心加入10毫升超纯水至烧杯中，并搅拌至化合物完全溶解。使用玻璃巴斯德移液管，向每个组织切片中加入约100微升新配制的漂白溶液，然后将载玻片置于通风橱内室温下孵育15分钟。

如果溴化溴化吡啶染料发生漂白，请小心将玻片转移至落射荧光显微镜，并选择dappy滤光片。对样本进行调焦，并以全功率照射。现在使用5倍物镜以获得更大的照明视野，并将载物台完全降低，以防止玻片与物镜或镜筒之间发生任何接触。

最后，使用玻璃巴斯德移液管将每个孔中的硼氢化锂溶液倾倒出来，并倒回原始的漂白溶液烧杯中。用稀释缓冲液洗涤载玻片三次，每次洗涤孵育约三分钟。加入抗体混合液，并按照之前所示方法对样本进行染色。

未经处理的鼻息肉组织经CD3、CD4和CD20染色后，在嗜酸性粒细胞富集区域显示出强烈的非特异性颗粒状荧光，而真实的膜定位信号则以较低强度存在。使用5%脱脂牛奶预处理未能完全阻断非特异性荧光，同时也降低了AF 532等荧光染料的信号强度。

使用Dab预处理可降低CD20、CD3和CD4的非特异性荧光，但同时也降低了包括DAPI和AF 532在内的多个通道的真实信号强度。肝素预处理能有效阻断非特异性结合，同时保持CD3、CD4、CD20和DAPI的高信号强度。肝素以浓度依赖的方式阻断非特异性信号，在10单位时达到完全抑制，且在更高浓度下未观察到不利影响。

三通道成像设置缩短了采集时间，但引入了串扰，包括AF 594渗漏至PE通道，以及由于多次激光激发导致的组织自发荧光增强。光谱成像几乎消除了所有背景信号和串扰，同时减少了采集时间并提高了信噪比。对一个人类鼻息肉进行光谱IBEX成像，揭示了由EpCAM标记的上皮结构。

CD3阳性与CD20阳性的淋巴细胞等免疫细胞，以及表达CD31和CD34的血管。肝素处理消除了颗粒结合，同时不降低信号强度，可在IBEX循环中持续保持强烈的背景抑制。光谱解混可最大限度减少信号串扰，降低自发荧光，提高信噪比，并显著加快多色面板的采集速度，相较于多通道共聚焦成像具有明显优势。

这能够实现强大的空间蛋白质组学分析，并支持对具有挑战性的组织进行精确的细胞状态定位和邻近水平分析。