使用流式细胞术测定红细胞补体受体1

本方案可用于测定目标细胞受体上抗原位点的数量。该技术的主要优势在于即使对于低密度表达的受体，也能获得可靠的结果。该方法能够评估红细胞CR1表达的减少情况，这种减少与阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、艾滋病和疟疾等疾病相关。

该方案适用于任何细胞受体密度的分析，也可用于通过荧光显微镜研究细胞受体表达。我们建议在分配细胞和抗体时将试管间隔放置，并尽可能在首次分析时由流式细胞术专家陪同操作。通过流式细胞术对免疫染色及密度进行可视化演示，对于正确设置分析参数至关重要。

开始分析前，从血液储存管中加入250微升含钠EDTA抗凝剂的全血至一个含有20毫升4摄氏度PBS-BSA的50毫升锥形管中。通过轻柔倒置混匀管内物质，并通过离心沉淀细胞。使用10毫升移液器弃去上清液，并小心地将沉淀物在残留的溶液中重新悬浮。

加入20毫升冷的PBS-BSA，再次离心细胞。离心结束后，将离心管置于冰上放置的试管架中，取8微升洗涤后的红细胞转移至含有3毫升PBS-BSA的50毫升离心管中。然后通过轻轻涡旋混合红细胞，以获得均匀的细胞悬液。

进行红细胞免疫染色时，将100微升稀释后的红细胞小心转移至各1.5毫升离心管中，通过离心收集红细胞。弃去上清液后，直接向每份细胞沉淀中加入20微升PBS-BSA缓冲液配制的生物素化抗CR1 J3D3抗体（浓度为0.5微克/微升）。向阴性对照细胞中仅加入20微升PBS-BSA缓冲液，并轻轻混匀，随后将所有样本在4°C条件下孵育45分钟。

孵育结束后，每次用750 µL新鲜的PBS-BSA缓冲液洗涤样品，每管洗两次。第二次洗涤后，每管加入20 µL用PBS-BSA稀释的链霉亲和素-藻红蛋白（1:10稀释），轻轻混匀，在4°C孵育45分钟。孵育结束后，按上述方法将样品洗涤两次。

第二次洗涤后，在涡旋振荡的同时，用450微升固定缓冲液固定每个细胞样品沉淀，然后将每个样品转移至各自的5毫升圆底管中，在4摄氏度条件下最多可保存48小时。为分析用于流式细胞术的免疫染色红细胞，请点击流式细胞仪中的“新建实验”按钮，并为新实验重命名。在细胞仪设置窗口中选择前向散射光、侧向散射光和PE。

在开放实验中，选择流式细胞仪设置的应用程序设置，并创建一个全局工作表，使用灰色方框和十字线来指导优化。当所有参数设置完成后，将未染色对照管加载到流式细胞仪上并开始采集数据，优化前向散射和侧向散射电压，以去除碎片信号，并确保目标细胞群处于量程范围内。接着，在前向散射与侧向散射图上围绕红细胞绘制门控区域，并在PE荧光的点图中显示红细胞群体。

如果阳性细胞群在量程范围内，将染色后的对照管上机并开始采集。为记录和分析样本，卸下染色样本，在新的全局工作表中创建前向散射光与侧向散射光图以及PE荧光直方图。将第一个样本上机，开始采集，并在前向散射光与侧向散射光图中围绕红细胞绘制红细胞门。

在PE荧光直方图中显示红细胞群体，并在统计选项卡中选择红细胞群体PE荧光参数的平均值。在采集仪表板中，选择停止门控中的所有事件以及要记录的10,000个事件，然后点击记录数据。当事件记录完成后，从流式细胞仪上取下试管。

全局工作表的图示应如图所示。通过对三名已知CR1密度的受试者红细胞进行免疫染色后的流式细胞术分析，可测量每位受试者标记的平均荧光强度。利用已知红细胞CR1密度受试者的数值绘制曲线，可将这些数据表示为平均荧光强度的函数。

将由此曲线得到的回归线与其他受试者的平均荧光强度值进行比较，可确定其红细胞CR1受体密度。需注意确保红细胞和抗体充分混匀分布，使实验样本相对于阴性对照的校准曲线处于流式细胞仪设置的检测范围内。通过更换一抗和/或调整信号放大层，该方法可适用于测量其他细胞表面受体密度。

每次处理血液时，均存在病原体污染的风险。因此，务必遵循良好的实验室操作规范，并穿戴适当的个人防护装备。