人工细胞外基质（aECM）蛋白的设计与构建 大肠杆菌 用于皮肤组织工程

本实验的总体目标是展示构建和生产含类弹性蛋白重复序列的人工细胞外基质蛋白（A ECM）的各个步骤。首先构建编码A ECM蛋白的重组基因，随后将这些重组基因导入细菌宿主中，从而实现该目标。

此时，重组蛋白在细菌宿主中表达，并通过细胞裂解进行蛋白提取后收获。最后一步是利用逆向相变循环（ITC）纯化蛋白，该方法利用了弹性蛋白类似多肽所具有的独特相变特性。

离心步骤在 4 摄氏度和 37 摄氏度下进行。最终，通过凝胶电泳和蛋白质印迹技术鉴定重组蛋白并确定其纯度。与亲和层析柱等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够以相对较低的成本提取大量蛋白质。

按照文本方案中所述，首先完成所有引物设计。获得寡核苷酸后，退火DNA寡核苷酸以得到目标基因序列。首先将DNA寡核苷酸溶解于DNA寡核苷酸缓冲液中，使其终浓度为每微升一微克。

向每种全配体中加入4 µL，再加入32 µL DNA及退火缓冲液，制成总体积为40 µL的混合液。随后使用加热板将烧杯中的水煮沸，并将混合液浸入其中孵育5分钟。在95 °C条件下孵育后，取出烧杯并将其整体置于泡沫塑料盒中过夜缓慢冷却，此时寡核苷酸已退火完毕，可进行后续消化反应。

按照文本方案中的说明，分别向目标寡聚体和宿主载体中加入相应的限制性内切酶，在 37 摄氏度条件下消化三至四小时。将消化产物在琼脂糖凝胶上电泳后，纯化 DNA，随后按顺序连接目的基因：使用 T4 连接酶将消化后的 DNA 片段插入质粒载体中。根据文本方案中提供的配方，将连接反应体系在室温下孵育两小时。

接下来，通过热激法转化细胞，由Ali操作。取50 µL感受态细胞加入预先冰浴的洁净微量离心管中。向细胞中加入5 µL连接反应混合物，轻轻吹打数次以混匀。

将混合物置于冰上静置20分钟。然后将含有细胞混合物的微量离心管浸入42摄氏度水浴中2分钟，再放回冰上2分钟。向微量离心管中加入500 µL SOC培养基，于37摄氏度振荡培养1小时。

孵育后，取50至500微升细胞连接混合物，涂布于已预热至室温的含氨苄青霉素的2×YT琼脂平板上。将平板倒置于37摄氏度过夜培养。次日，使用洁净的移液器吸头从琼脂平板上挑取DNA菌落。

将菌落于5 mL含有氨苄青霉素的2×YT培养基中，37 °C振荡培养过夜。次日，按照试剂盒生产商的说明书，使用质粒提取试剂盒提取各菌落的质粒DNA。

转化重组质粒至细菌表达宿主后，用50微升水洗脱所挑选的菌落以获得DNA，具体操作如文本方案所述。用移液器吸头从转化后的平板上挑取单个菌落，接种于含有氨苄青霉素和氯霉素抗生素的10毫升无菌TB培养基（terrific broth）试管中。

将该种子培养物在37摄氏度、225 RPM振荡条件下过夜培养。然后取10毫升种子培养物转移至一个含有1升新鲜无菌TB培养基的3升锥形瓶中，培养基中需添加相同的抗生素。

将培养物在37摄氏度、225 RPM的振荡条件下孵育两到三小时。通过移液将一毫升培养物加入空的比浊杯中，测定其在600纳米处的光密度（OD 600），确认光密度值达到0.6至0.8。随后，加入IPTG诱导培养物，使其终浓度为1毫摩尔，并在37摄氏度、225 RPM振荡条件下继续孵育四小时。

将培养物转移至一升离心瓶中，于4°C、12,000 G离心30分钟收集细胞。弃去上清液后称量细胞沉淀，并以每毫升0.5克的浓度用10缓冲液重悬。将重悬的细胞培养物于-80°C冷冻过夜。

第二天，在室温水浴或冰上解冻冷冻的细胞培养物。向细胞中加入脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶A和苯甲基磺酰氟。在溶液解冻的同时，用缓慢搅拌使其充分匀浆。

所有重悬细胞解冻后，需极其小心地将溶液调节至 pH 9.0，以提高蛋白质在水中的溶解度。在冰上搅拌条件下，逐滴加入 6 N 氢氧化钠，直至形成均匀的溶液。随后在冰上使用直径为 2 毫米的平头探针，以 5 秒脉冲方式进行超声破碎，总时长为 20 分钟，以裂解细胞。

将细胞溶液在 4 摄氏度下以 12,000 G 离心 30 分钟。将上清液转移至一个洁净的空瓶中，并在 4 摄氏度下保存，以备后续纯化。同时，用 10 倍体积的缓冲液重新悬浮细胞沉淀，并保留 20 微升细胞裂解液。

进行 SDS-PAGE 表征时，将重悬的细胞沉淀在 -80 摄氏度下重新冷冻，以完成细胞裂解。重复冻融和超声处理过程最多三次。合并前期获得的细胞裂解液，并在高盐条件下通过不同温度的离心循环，采用 ITC 方法纯化 A 型 ECM 蛋白。

将细胞裂解液分装至50毫升离心管中，在4°C条件下以40,000 × g离心两小时。用移液器小心移除上清液，确保与沉淀充分分离。将上清液收集至洁净的离心管中，并加入氯化钠至终浓度为1摩尔。

将溶液在 37 摄氏度下振荡孵育两小时，转速为 225 转/分钟。随后进行离心，在 37 摄氏度下以 40,000 ×g 离心两小时，收集上清液。

倾去上清液后，用金属刮刀将沉淀压碎，并将沉淀碎片重新悬浮于冰中。加入冷的经高压灭菌的蒸馏水，使用磁力搅拌子和搅拌板在4°C下剧烈搅拌过夜，直至沉淀完全溶解。重复此循环过程，直至37°C下的沉淀呈白色，此时可将其在水中过夜溶解，然后离心。

为获得蛋白质溶液，将蛋白质溶液在4摄氏度下通过透析脱盐，使用蒸馏水作为透析液，每4小时或8小时更换一次水，过夜进行，持续2至3天。保留20微升纯化的蛋白质用于SDS-PAGE分析，其余纯化的蛋白质按图示进行冻干。在诱导样品中，可见一条位于预测分子量位置的明显蛋白质条带。图中还显示了SDS-PAGE凝胶，其中包含一个分子量为22千道尔顿的纯化蛋白质样品，对应于层粘连蛋白五A ECM。

经估计，A ECM 蛋白的纯度约为 90% 至 95%。该数值是通过比较 SDS 凝胶上目标蛋白条带与其他蛋白条带的条带强度比值得出的。最后，为了确认所纯化的蛋白确实是 A ECM 蛋白，本实验进行了蛋白质印迹（Western blotting）。三种 A ECM 蛋白的蛋白纯度通过 SDS-PAGE 凝胶展示，并与用于 Western blotting 的硝酸纤维素膜图像进行对比。

分析结果显示存在目标蛋白胶原蛋白四A ECM和层粘连蛋白五A ECM，这些蛋白使用与辣根过氧化物酶偶联的抗六组氨酸标签抗体进行标记。A ECM蛋白的最终得率介于每升60毫克至每升120毫克之间。观看本视频后，您应能充分掌握如何针对特定应用表达和纯化含有弹性蛋白样结构域的蛋白质。