利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化 原位 邻近连接实验
2018年10月20日
本文展示了如何利用邻近连接实验（PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。
原位邻近连接技术（PLA）是一种能够在固定组织和细胞中检测蛋白质间相互作用的技术。该技术无需转基因表达或额外的其他技术手段，即可识别并定量蛋白质之间的相互作用。其唯一要求是具备可与DNA寡核苷酸修饰的高效特异性抗体。
在组织中，MST1 和 MST2 主要以活性同源二聚体形式存在，但致癌刺激可增加 MST1 与 MST2 异源二聚体的水平，而此类异源二聚体是无活性的。在使用针对目标蛋白的特异性一抗孵育后，加入特殊的特异性二抗，每种二抗均连接了一条独特且较短的互补 DNA 链，并被添加至加样孔中，以结合一抗。如果目标蛋白形成了异源二聚体，则结合在蛋白上的一抗和二抗将彼此靠近。
在此状态下，通过后续加入两种成环DNA寡核苷酸，第二抗体上连接的DNA链可发生相互作用。经过扩增反应后，DNA环可实现数百倍的复制，并由层级互补的寡核苷酸探针产生荧光信号。因此，每个检测到的信号均表现为独立的荧光点，可根据显微镜图像将其定位至特定的亚细胞位置。
实验前一天，向16孔板中加入50至100微升小鼠层粘连蛋白或聚-L-赖氨酸进行包被，并在37摄氏度下孵育。30分钟后去除冷溶液，用胰蛋白酶消化细胞，将15,000至25,000个细胞接种至16孔板的每个孔中。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育24小时。
24小时后，从孔中移除培养基，并用PBS轻轻洗涤细胞。使用移液器以尽量降低样本损失的风险，然后吸去PBS，并通过每孔加入50微升4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，在室温下静置孵育10分钟，期间不进行震荡。切勿将溶液直接滴加到细胞上，以免导致细胞脱落。
固定后，用 TBST 轻轻振荡洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。接着对细胞进行通透处理，在室温下孵育 10 分钟，期间不振荡。通透完成后，用 TBST 振荡洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
除去 TBST 后，向每个孔中加入一滴封闭液，并将切片置于预热的湿盒中，于 37 摄氏度孵育一小时。稀释一抗。使用微量移液器去除封闭液，但切勿让切片干燥。
涡旋混匀后，向相应的孔中加入40微升稀释的抗体溶液，在预热的湿盒中37摄氏度孵育一小时。孵育期间，用抗体稀释液稀释两种PLA探针。每个样本准备40微升PLA探针。
孵育一小时后，吸去抗体溶液，用 TBST 在室温下洗涤载玻片两次，每次五分钟。轻轻移除载玻片上的 TBST，每孔加入 40 µL PLA 探针溶液。将载玻片置于预热的湿盒中，在 37 °C 下孵育一小时。
使用前立即用高纯度水涡旋并稀释连接反应原液1至5至所需体积。每个孔需要40微升连接溶液。孵育结束后，从载玻片上移除PLA溶液，并在室温下用TBST振荡洗涤两次，每次五分钟。
从冰箱中取出连接酶时使用预冷的冰块，并在将其加入细胞前涡旋混匀，用连接反应液稀释。移除载玻片上的TBST溶液，每孔加入40微升连接反应酶混合液。将载玻片置于预热的湿盒中，在37摄氏度孵育30分钟。
孵育后，吸去溶液，用 TBST 在室温下振荡洗涤两次，每次五分钟。避免将孔板暴露于强光下，因为试剂对光敏感。在最后一次洗涤期间，使用前立即用高纯水涡旋并稀释所需体积的扩增溶液。
将聚合酶置于冰上或冷却块中，在加入细胞前轻轻涡旋并用扩增溶液稀释。吸去各孔中的TBST，每孔加入40 µL扩增溶液。将切片置于黑暗、预热的湿盒中，在37°C下孵育100分钟。
孵育结束后，从载玻片上吸除扩增聚合酶溶液，并在室温下用TBST洗涤两次，每次十分钟。彻底移除载玻片上的反应腔室及加样孔周围的硅胶。用刀片刮去残留的硅胶颗粒。
在载玻片上绘制网格，以分隔每个孔。加入约 40 µL 含 DAPI 的封片剂，确保盖玻片下无气泡产生。使用指甲油固定盖玻片。
固定后20分钟即可进行显微分析，但在实际操作中，我们发现次日进行图像分析最为方便。为分析样品，我们使用Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜。图中A至D面板展示了原位邻近连接实验的结果，用于可视化人胚胎肾细胞中MST1与MST2蛋白之间的紧密邻近关系；E至H面板则展示了人施万细胞中的相应结果。所有图中，细胞核经DAPI染色呈蓝色，红色点状信号表示由所指示蛋白之间紧密邻近所产生的阳性邻近连接实验信号。
图A显示MST1与MST2之间的邻近关系，图B显示ERK与其磷酸化形式phosphoERK的邻近关系，因为这些表位位于同一蛋白上。图C为阴性对照，其中细胞同时表达MST1和MST2；图D为第二个阴性对照，使用针对MST1和ERK的抗体进行染色，这两种蛋白预期彼此之间不发生邻近结合。图E和图F分别显示雪旺细胞中MST1与MST2、ERK与phosphoERK之间的邻近信号。
图G和图H为阴性对照，仅使用MST1抗体或MST1与ERK抗体进行染色。必须使用不发生交叉反应的一抗，确保其仅识别异源二聚体中的一个成员。同时需注意：使用不同的枪头以避免一抗和PLA探针之间的交叉污染，避免触碰孔板底部，并避免将液体直接加在样本上。
观看本视频后，您应能够充分理解如何利用原位邻近连接技术（in situ PLA）在固定细胞中研究蛋白质二聚化。
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概述
本文展示了一种利用邻近连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体形成的方法。PLA技术可实现蛋白质相互作用的原位检测，有助于深入了解蛋白质复合物的动态特性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 蛋白质相互作用
背景
- 邻近连接检测（PLA）是一种用于检测蛋白质相互作用的强大方法。
- MST1 和 MST2 主要以同源二聚体形式存在，但在特定条件下可形成异源二聚体。
- 异源二聚化可能影响蛋白质活性及细胞信号传导。
- 高效率抗体对于 PLA 技术至关重要。
研究目的
- 在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。
- 展示PLA方法检测蛋白质相互作用的灵敏性。
- 探讨MST1/MST2异源二聚体在细胞环境中的生物学意义。
使用的方法
- 原位邻近连接实验（PLA）
- 使用针对MST1和MST2的特异性一抗
- 应用与DNA链连接的二抗
- 基于邻近关系的蛋白质相互作用定量
主要结果
- 在固定细胞中成功可视化MST1/MST2异源二聚体。
- 展示PLA在检测蛋白质相互作用方面的高灵敏度。
- 确定促进异源二聚化的条件。
- 揭示MST1/MST2相互作用的功能意义。
结论
- PLA 是研究固定细胞中蛋白质相互作用的有效工具。
- MST1/MST2 异源二聚化可能在细胞信号传导中发挥关键作用。
- 该方法可应用于多种生物学背景下其他蛋白质相互作用的研究。
常见问题
行业重要性概要
邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）能够在固定细胞中灵敏地检测内源性蛋白质异源二聚体的形成，有助于早期发现阶段的靶点验证。通过在无需转基因表达的条件下可视化MST1/MST2之间的相互作用，PLA可提供机制层面的深入见解，从而为信号通路的风险评估和信号传导研究的预测可靠性提供支持。该技术有助于优先筛选治疗假设，并减少临床前决策中的生物学不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过检测生理相关背景下内源性MST1/MST2异源二聚体的形成，验证治疗假设。
- 操作价值：利用物种特异性的一抗，实现高灵敏度和高特异性的功能靶点验证。
- 预测价值：通过可视化致癌刺激下非活性异源二聚体的形成，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：通过确认蛋白质相互作用状态，为下游筛选准备经过验证的生物系统。
- 定量输出：产生与邻近程度成正比的可扩增荧光信号，实现标准化检测。
- 平台可重复使用：仅需两种来自不同物种的靶标特异性一抗以及寡核苷酸连接的二抗，支持检测方法的可扩展性。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：将MST1/MST2异源二聚化与致癌信号通路关联，为通路分析提供具有疾病相关性的研究体系。
- 转化连续性：通过亚细胞定位信息，将发现阶段的相互作用数据与临床前验证相衔接。
- 风险调整决策：通过识别调控蛋白复合物活性的条件，为推进研究的决策提供依据。
流程与工作流整合
PLA 可融入从靶点结合到先导化合物鉴定的发现全过程，通过提供支持“进行/终止”决策的二元、空间分辨相互作用数据。
- Discovery Biology: 在天然细胞环境中验证蛋白质二聚化状态和信号通路组织的假设。
- Screening: 提供可重复的定量邻近测量，用于评估化合物对蛋白质相互作用的影响。
- Analytics: 通过每细胞的荧光点计数作为可量化的读数，用于比较不同实验条件。
- Translational Research: 通过将相互作用变化与疾病模型中的功能结果关联，支持生物标志物研究策略。
- Enterprise Reuse: 建立可重复使用的技术能力，只要有合适的抗体对，即可用于研究任何蛋白质相互作用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过最小化细胞干扰来检测内源性蛋白质相互作用，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的固定、探针结合和扩增步骤确保实验可重复性。
- 战略价值：在与疾病相关的系统中提供靶点调控的直接证据，从而优化决策流程中的“推进/终止”判断。
- 项目组合影响：基于相互作用动态和通路背景，实现对靶点的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备免疫荧光和探针操作的专业知识，以避免交叉污染。
- 依赖于获取高效、物种特异性的初级抗体以及PLA探针试剂盒。
- 必须采用标准化的洗涤和孵育流程，以保持信号的完整性。
- 需根据不同细胞类型和固定条件进行优化，以确保靶点可及性。
- 受限于抗体的可获得性，以及在致密蛋白复合物中可能存在的空间位阻效应。
