内质网与线粒体相互作用的研究方法 原位 固定细胞中的邻近连接测定
2016年12月10日
在此，我们介绍一种高灵敏度可视化和定量固定细胞中内质网与线粒体之间内源性相互作用的方法。该方案采用了一种优化的 原位 靶向线粒体相关膜界面处的三磷酸肌醇受体/葡萄糖调节蛋白75/电压依赖性阴离子通道/亲环素D复合物的邻近连接 assay
本实验的总体目标是利用原位邻近连接技术，在固定细胞中可视化并量化内质网与线粒体之间的相互作用。该方法有助于回答生物医学领域中的关键问题，通过简单的免疫荧光技术更深入地分析固定细胞中的内质网-线粒体相互作用，有望为疾病治疗策略提供新的思路。该技术的主要优势在于，我们能够在固定细胞中实现对内质网与线粒体相互作用的可视化与定量分析，并且该技术还可应用于患者石蜡包埋组织活检样本。如本视频所示，在原位邻近连接实验中，针对线粒体外膜VDAC1的鼠源一抗与针对内质网膜IP3R1的兔源一抗会结合至线粒体相关膜（MAM）界面处彼此邻近的抗原表位。随后加入带有DNA尾端的邻近连接探针，这些探针分别靶向鼠IgG和兔IgG，可在邻近蛋白存在时形成连接寡核苷酸连接的模板，并通过Texas Red标记的寡核苷酸进行扩增与可视化检测。此反应仅在两种靶蛋白间距小于40纳米时发生，该距离与线粒体相关膜界面上两个细胞器膜之间的实际距离相符。为进行原位邻近连接实验的细胞固定与封闭，将人H7细胞以每孔150,000个细胞的密度接种于未编码的35 mm玻璃底培养皿中。次日，移除培养基，用1 mL PBS洗涤细胞。吸除缓冲液后，加入1 mL 10%甲醛溶液，在室温下振荡孵育10分钟以固定细胞。为终止固定反应，加入1 mL 1 M甘氨酸溶液，并通过旋转混匀培养皿。吸除甘氨酸溶液后，加入1 mL 1×PBS。短暂振荡后吸除缓冲液。接着向细胞中加入1 mL 100 mM甘氨酸溶液，在室温下振荡孵育15分钟。吸除溶液后，加入含0.1% Triton X-100的1 mL PBS对细胞进行透化处理，并重复孵育步骤。吸除去垢剂后，加入1 mL PBS洗涤细胞。移除缓冲液后，向每个培养皿中加入40微升封闭液，将样本置于37摄氏度湿盒中孵育30分钟。孵育结束后轻敲去除封闭液，尽量使每张片子残留的缓冲液体积相等，同时避免样本干燥。为开展邻近连接实验，使用PBS稀释一抗溶液，涡旋混匀后加入培养皿中，在4
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概述
本文介绍了一种高灵敏度可视化和定量固定细胞中内质网与线粒体相互作用的方法。该方法利用优化的原位邻近连接实验，靶向线粒体相关膜界面的特定蛋白质复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 生物化学
背景
- 内质网和线粒体在细胞代谢中发挥着关键作用。
- 理解它们之间的相互作用对于阐明细胞功能至关重要。
- 邻近连接实验为研究蛋白质相互作用提供了一种灵敏的方法。
- 本研究聚焦于参与这些相互作用的特定蛋白质复合物。
研究目的
- 建立一种可视化内质网-线粒体相互作用的方法。
- 以高灵敏度定量分析这些相互作用。
- 加深对细胞代谢和信号传导机制的理解。
使用的方法
- 原位邻近连接实验
- 靶向肌醇1,4,5-三磷酸受体
- 葡萄糖调节蛋白75的参与
- 电压依赖性阴离子通道与亲环素D复合物的分析
主要结果
- 成功可视化内质网-线粒体相互作用。
- 对膜界面处蛋白质复合物进行定量分析。
- 展示出检测相互作用的高灵敏度。
结论
- 该方案可用于深入研究细胞间的相互作用。
- 获得的见解有助于理解代谢过程。
- 该方法可应用于多种生物学研究领域。
常见问题
行业应用价值
定量分析内源性内质网-线粒体相互作用对于降低与细胞信号传导和代谢调控相关的早期发现假设的风险至关重要。原位邻近连接检测技术能够灵敏、多重地检测细胞器接触位点，且无需蛋白过表达，从而提高在疾病相关体系中的预测可信度。该能力有助于在靶点验证与机制通路分析的交叉领域加强项目组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在分子水平上直接观察和定量内质网与线粒体之间的接触。
- 通过在固定的细胞和组织活检样本中确认内源性蛋白质的邻近关系，支持机制层面的风险评估。
- 有助于验证涉及钙信号传导和细胞器间通讯通路的功能性靶点。
- 提高对与代谢和信号传导障碍相关靶点的推进预测信心。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化、可重复的检测方法，用于在亚细胞器分辨率下定量蛋白质-蛋白质相互作用。
- 支持多条件测试，以评估化合物或基因扰动对内质网-线粒体接触的影响。
- 提供适合在不同实验组间进行比较分析的定量结果。
- 支持检测方法的可扩展性及平台重复利用，适用于更广泛的筛选研究。
转化与临床前研究
- 通过在患者来源的组织活检样本中进行分析，与疾病相关系统保持一致。
- 在细胞器相互作用靶点的发现到临床前验证过程中，维持转化研究的连续性。
- 通过提供通路激活的机制性证据，支持基于风险评估的推进策略。
流程与工作流整合
这种原位邻近连接检测法通过实现对固定细胞和组织中内质网-线粒体相互作用的稳健定量，架起了早期发现与临床前研究之间的桥梁。
- 发现生物学：支持细胞器互作机制的假设验证和通路阐明。
- 筛选：为化合物或遗传筛选项目提供可重复、定量的检测结果。
- 分析：可灵敏检测40 nm以下的蛋白质邻近关系，实现相互作用频率的统计学比较。
- 转化研究：在与疾病相关的样本中促进生物标志物的关联分析和机制验证。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，支持多个研发项目中多样化的蛋白质相互作用研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：以高灵敏度和高特异性实现内源性蛋白质相互作用的标准化检测。
- 战略价值：通过在研发早期提供可靠的机制数据，支持更优的立项/终止决策。
- 项目组合影响：支持基于已验证的细胞器相互作用特征，对靶点进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备免疫荧光和邻近连接实验技术的专业知识。
- 需要获取高质量的抗体以及荧光成像基础设施。
- 要求跨团队标准化操作，以确保不同研究间定量结果的可重复性。
- 可适用于细胞系和石蜡包埋的组织活检样本，具有转化研究的相关性。
- 仅限于固定样本，不适用于活细胞动态相互作用研究。
