亚结构分析器：一种用于快速探索与精确分析荧光显微图像中细胞结构的用户友好型工作流程

亚结构分析器是一种用户友好的工作流程，可自动分析多种过程显微镜指标。它并非指零吨开源软件 Icy，同时也利用了机器功能。重要的是，该工作流程是一种经济可行的方案，可用于知识获取和图像分析。

在工作流程中加载多通道图像，并进行预处理，以提高信噪比并去除成像伪影或缺陷。随后，图像分割将感兴趣区域（即ROIs）从背景中分离出来。根据聚类程度和感兴趣对象的性质，可选择多种分割方法。

分割后的对象将使用特定描述符保存在指定文件夹中。随后在行内对力和信号进行分析，并提取多个特征，如位置、大小、形状、密度纹理等，而数量和大小等数据则导出至自动生成的电子表格中。请从 Icy 官方网站下载 Icy 软件。

然后从 Icy 协议库中下载子结构分析协议。打开 Icy，点击功能区菜单中的“工具”。点击“协议”以打开协议编辑界面。

单击加载并打开协议子结构分析器。协议加载可能需要几秒钟。该工作流程由13个通用模块组成，每个模块作为一个流水线，包含多个执行特定子任务的方框。

每个模块或方框均标有编号，并在工作流程中具有特定的等级。单击该编号后，将所选模块尽可能分配到最靠前的位置，其余模块的位置将相应重新排列。

单击左上角图标可折叠或展开该模块。该模块还可放大、缩小或删除。工作流程中的每条管道均由多个通过输入和输出相互连接的方框网络正确构成。

要建立连接，请点击输出端并保持按住，直到光标对准任意输入端。可通过点击输出标签来删除连接。如有需要，请重命名文件，使待合并的序列具有相同的名称前缀，并以不同的分隔符结尾。

例如，图像 A 中各个通道的序列命名为 image A_underscore_red、image A_underscore_blue，依此类推。在同一文件夹中，为每个待合并的通道创建一个新的文件夹。例如，要合并红色、绿色和蓝色通道，需创建三个文件夹，并将相应的序列分别存储在这些文件夹中。

仅使用合并通道模块，移除其他模块，并将该方案另存为合并通道。通过访问各个设置框来设定参数。在通道编号 x 的设置框中，选择要提取的通道。

在传统的 RGB 图像中，0 代表红色，1 代表绿色，2 代表蓝色。在文本框中，文件夹通道编号 x，反斜杠后为包含通道 x 图像的文件夹名称。在文本框中，分隔通道编号 x。

用于图像名称的分隔符。在“颜色通道映射通道数 x”框中，输入一个数字，以指定在 Icy 中可视化相应通道时所使用的模型列。在“合并图像格式”框中，填写用于保存合并图像的文件扩展名。

在合并通道模块的左上角，单击“文件夹”右侧的链接。在弹出的打开对话框中，双击包含已在“文件夹通道编号一”框中定义的第一个通道序列的文件夹。然后单击“打开”，运行该方案。

合并后的图像将保存在与各通道文件夹相同目录下的“merged”文件夹中。目标分割是图像分析中最具有挑战性的步骤，其效率决定了最终测量结果的准确性。

因此，结构分析器整合了简单和更复杂的算法，以提供针对图像复杂性和用户需求的不同方案。如果对象彼此不接触，则用户无需单独区分成簇的对象，可使用块分割 A。当对象彼此不接触但部分对象间距较近时，使用块分割 B。对于聚类程度高且呈凸形的对象，使用块分割 C。若对象具有较高的聚类程度且形状不规则，则使用块分割 D。在细胞质聚簇中使用块分割，利用已分割的细胞核作为标记，单独分割相互接触的细胞质。用于初级对象分割的块可独立运行，因此可在同一次分析中使用多个块，以比较其对特定亚结构的分割效率，或用于分割不同类型的亚结构。

为了说明分割方法，我们选择了能够适应更多问题的块分割 B。要使用此博客，请首先将其链接到选定的文件夹。

然后，调用通道信号以设置待分割对象的通道。例如，为与 HK 框中的 B 对应，需设置强度类别参数以及待检测对象的近似最小和最大尺寸（以像素为单位）。对于强度类别，设置值为 2 时，会将像素分为两类：背景和前景。

因此，当物体与背景之间的对比度较高时，该方法适用。如果前景物体的原始强度较低，或与背景的对比度较低，则应增加类别数量。在盒装主动轮廓中，可优化物体边界的检测。

在此过程中，将创建一个文件夹以保存已分割对象的图像。在文本框中为此文件夹命名，例如“分割细胞核”。在“已分割对象图像的格式”框中设置保存已分割对象图像的格式，然后运行该方案。

文件夹将创建在包含合并图像的文件夹中。已开发出不同的模块，以适应在已分割对象中需分析的规则数量、通道数量以及细胞区室。在以下示例中，进行分析时请选择“荧光分析 P”模块——同一区室中的两个通道，并将其链接至“选择文件夹”。

在执行此分析之前，应已完成分割模块的处理。请在参数设置中指定包含分割对象图像的文件夹路径，在文件夹名称前加上反斜杠。分割对象图像的输入文件夹格式，请填写用于保存分割对象图像的文件格式。在“去除边界对象”选项中，选择是否移除位于图像边界的分割对象。

否则，目前必须安装更完整的 J 成像工具集才能使用此功能。在“通道斑点信号”设置框中，指定需要检测斑点的通道。在经典的 RTP 图像中，通道零为红色，通道一为绿色，通道二为蓝色。

在“定位分子名称”框中，填写定位于斑点中的分子名称。需回答的字段数量取决于分子的数量。在“每检测器通道的波长”框中，为每个独立通道设置斑点检测参数。

为了在房间内处理不同的模块，请使用模块选择文件夹保留所选模块的连接，并确保它们的排序位于工作流程良好处理的顺序之下。在运行工作流程之前，建议删除未使用的模块，并将新协议另存为其他名称。

单击“运行”以启动工作流程。当程序打开时，会出现“eye look books”界面。双击包含护士图像的文件夹，然后单击“打开”，工作流程将自动运行。

如果处理完成，右下角将显示工作流已成功执行的消息，所有模块均会标有绿色标记。若未完成，则带有箭头符号的模块及其内部框将指示需要修正的元素。重要的是，多个显示界面可用于在每次运行过程中可视化中间结果，以监控处理过程。

该工作流程的快速性、灵活性和功能性将通过多个示例加以说明。在第一个示例中，我们分析了在使用不同浓度的TNF alpha刺激后，NF kappa B的核转位情况。细胞核和细胞质通过分割C和E模块进行界定。

采用全局转位分析模块对NF kappa B信号增强现象进行分析。在26分钟内分析了96张图像中的超过40,000个细胞。所获得的数据用于建立该剂量反应曲线，显示TNF alpha诱导NF Kappa B核转位的效果。

该工作流程还可用于检测文件大小并提取有关其特征的特定信息。此处，通过定位蛋白质的EDC来检测单个细胞中的特性。细胞质中的细胞核则通过分割A和E区块进行界定。

使用荧光分析模块 C 对 EDC4 进行了分析。在此示例中，已在所分析的两种细胞中均检测到细胞质内的 EDC4 信号。每个完整边的像素大小已在电子表格中给出。在此示例中，我们利用该工作流程的灵活性，对碳水化合物在更长时间内的氧化应激动力学进行了研究。

coilin 的核力信号是碳水化合物的主要结构组分，其数量和大小根据尺寸以及通过 53BP1 定位的双链断裂所评估的应激状态进行分析。细胞核通过分割代理进行界定，使用荧光分析模块 B 同时分析核力以及 coilin 和 53BP1 的信号。基于来自 2300 个单个细胞的数据，我们发现应激诱导后 Greenfield 位点的数量显著增加，同时其尺寸减小。该数据强烈表明，氧化应激会改变碳水化合物的成核能力，使核质分布转变为更多但更小的核位点，从而证明 coilin 表达的改变可能影响其定位，并改变曲线体的成核过程。

过表达了一种外源性GFP-coilin融合蛋白。根据GFP-coilin的过表达水平分析了我们身体的特征。使用分割模块A界定细胞核。使用荧光分析模块B同时分析coilin和GFP-coilin的荧光信号。GFP-coilin的过表达水平通过单个细胞核中GFP信号的平均密度来反映。

亚结构分析仪生成的数据表明，GFP-coilin过表达显著增加了碳水化合物的大小和数量。由于氧化应激会增加碳水化合物的数量但减小其大小，该数据可能反映出氧化应激对碳水化合物结构的影响很可能是由其成分改变所致，而非由coilin特定含量变化引起的作用。

因此，结构分析器是一种高度模块化的生物图像分析工作流程。它可适用于多种场景，从简单的通道合并到对成千上万个细胞中的多个层面和信号进行量化。它还根据图像复杂性整合了简单和复杂的分割算法，并能自动提取荧光信号特征。