AMEBaS：极化单细胞比率荧光延时成像的自动中线提取与背景扣除

该方法通过表达特定目标（如肌动蛋白、离子或囊泡动态）的荧光报告分子或染料，定量分析极化细胞沿其中轴线的时空动态。自动化版本消除了人为偏差，并提高了可扩展性，尤其适用于那些原本需手动进行数字化操作、耗时且易受主观影响的任务。首先，打开 Jupyter Notebook 并读取延时成像文件，可通过访问 Google Colab 交互式笔记本主页，或从 GitHub 下载并打开 AMEBaS_local IP YNB 文件来实现。

使用本地版本准备输入和输出数据的目录结构时，将荧光延时成像文件（TIF 或 DV 格式）放入程序根目录下名为 data 的文件夹中。创建一个 out 文件夹用于接收生成的数据，然后运行设置代码块。如果在 Google Colab 中使用笔记本，请执行设置代码块以自动生成 data 和 out 文件夹，然后运行文件输入代码块，通过点击播放按钮读取延时成像数据。

如果使用 Google CoLab，请通过点击“选择文件”按钮将延时成像文件上传至数据文件夹。接下来，通过将 verbose 参数设置为 true 或 false，选择是否为每一步生成额外输出。为了检测主要细胞并将其与背景分离，请点击播放按钮运行单细胞分割代码块，以自动将目标细胞从背景中分离出来。

调整 sigma 变量中的 sigma 值，以精细调节分割掩膜的平滑程度。默认值为 2.0。现在将变量 estimate 设置为 false，以直接从 ISO 数据中存储估计的阈值；或设置为 true，以通过局部多项式回归在相邻帧之间对阈值进行平滑处理。

调整 n_points 变量以微调函数，默认值为 40。要沿细胞突起追踪中线，请通过点击播放按钮运行细胞中线追踪代码块，使用 Lee 方法对细胞进行骨架化，并通过线性外推法延伸最后一个骨架的末端。接下来，通过调整 complete_skeletonization 参数选择中线追踪选项，以在最后一帧上进行追踪，或每帧追踪一次。

调整 interpolation_fraction 变量以设置在延伸过程中用于插值的骨架点比例，默认值为 0.25。接下来，修改 extrapolation_length 变量以确定中线延伸的长度。

默认值为负一，这会将骨架延伸至最近的边缘。现在通过点击播放按钮运行第一个数据可视化代码块，以自动生成两个通道的显微轨迹图。通过调整 kymograph_kernel 变量来选择用于平滑处理的高斯核大小。

为了正确显示非延伸骨架的强度，需要为其加帽的显影图（kymograph）设置自定义的颜色映射。调整 shift_fraction 变量，以选择将被指定为背景色（黑色）的强度所占的百分比。然后点击播放按钮运行第二个数据可视化代码块，自动生成比率度量显影图和时间序列图像。

调整 switch_ratio 变量以更改在比值计算过程中作为分子和分母的通道顺序，默认值为 false。通过调整 smooth_ratio 变量，检查比值时间序列是否需要通过中值滤波进行额外平滑处理，默认情况下该值为 false。

接下来，通过调整 reject_outliers 变量选择是否移除或保留由于分母通道信号过低而产生的离群值。离群值定义为高于第三四分位数1.5倍四分位距的数值。最后，通过调整 background_ratio 变量选择是否导出背景值和比值指标结果。

默认情况下为 false，表示将背景替换为零。AMEBaS 在多个数据集上进行了测试，例如表达钙离子探针 cameleon 的花粉管、表达 pH 指示剂 florin 的花粉管，以及表达钙离子探针 NESYC 3.6 的根毛，尽管这些样本在生长方向、成像技术、荧光报告分子和细胞类型方面存在差异，但仍成功实现了分析。请记得执行该代码块，以安装所需的软件包。

此外，必须针对您的图像专门调整sigma值，以便获得更准确的结果。生成的显微轨迹图可用于分析目标信号的时空动态。此外，您还可以通过计算其寻找方法、生长过程和时间序列来分析正确的解决方案。