测量热休克反应诱导的标准方法 秀丽隐杆线虫

热激反应是一种重要的细胞应激反应通路，可维持秀丽隐杆线虫细胞质内的蛋白质稳态，并可在分子、细胞和个体水平上对其进行表征。本文介绍了一系列标准化的实验方案和最佳实践，可在线虫中 robust 地诱导热激反应，以促进该领域研究的可重复性。我们证明，常用于个体水平检测的耐热性实验并不依赖于热激反应。

相反，我们建议使用依赖于热休克反应的个体水平检测方法——热恢复实验。热休克反应会随着产卵开始而减弱。因此，在热休克反应实验中，发育时间是一个必须考虑的关键变量。

首先建立一个同步化的线虫群体。使用铂金丝挑取约10条带有卵的成虫转移至新鲜培养板中。确保去除随成虫一同转移的任何卵或幼虫。

让线虫产卵一小时，然后将成虫从培养皿中移除。将同步化的线虫在20摄氏度条件下培养至所需发育阶段，需注意发育时间因品系不同以及培养温度差异而有所变化。当线虫准备进行热激处理时，用石蜡膜包裹培养皿，并使用带有铅块的试管架将其完全浸入33摄氏度的循环水浴中，持续一小时。

从水浴中取出培养板，用纸巾擦干。移除石蜡膜，将线虫在20摄氏度下恢复6至24小时，此时间足以完成GFP的合成。为准备成像用的载玻片，将待用的载玻片置于另外两个载玻片之间，这两个载玻片上需贴有实验室胶带条。

在水中配制3%的琼脂糖溶液，放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解。然后使用1 mL移液器吸取约150 µL琼脂糖溶液，置于载玻片中央。立即用一片空白载玻片覆盖，将其垂直放置，使其接触实验室胶带并平稳覆盖，然后小心取下。

为了固定线虫，先在琼脂糖垫的中央加入一滴1毫摩尔的左旋咪唑（levamisole）M9缓冲液，然后用铂金丝挑取10条线虫转移至液滴中。可选步骤：将左旋咪唑向琼脂糖垫外缘推开，并在线虫瘫痪后用铂金丝将其排列整齐。盖上盖玻片，并立即使用荧光显微镜进行成像。

进行热恢复实验时，先同步线虫，并在20摄氏度下培养至所需发育阶段。随后进行6小时的热激处理。将培养板从水浴中取出，在20摄氏度下恢复培养48小时。

恢复后，计数那些在机械刺激后能够立即爬行离开、且无抽搐或麻痹现象的线虫数量。为了在细胞水平上观察热激反应的诱导情况，分析了两种带有荧光报告基因的秀丽隐杆线虫品系。在未进行热激的阴性对照样品中，hsp-16.2 报告基因表现出正常的自发荧光，而 hsp-70 报告基因在肛门舒张肌中呈现组成型荧光。

热激一小时后，当使用RNAi在检测报告基因诱导之前敲低hsf-1时，两个报告基因均观察到强烈的荧光信号。两种菌株的荧光均显著减弱，表明这些报告基因的表达依赖于hsf-1。为了在分子水平上定量热激反应的诱导情况，采用rt key PCR检测了两种内源性热激蛋白。

研究发现，33摄氏度、持续一小时的热激可使两个热激基因的相对表达量增加2,000倍以上。热恢复实验表明，经历六小时热激后，在48小时恢复期结束时，正常运动的线虫比例下降了20%。hsf-1基因敲低导致线虫正常运动能力显著下降，超过95%的线虫在受到刺激后表现出抽搐性运动或瘫痪。

相比之下，hsf-1 的敲低对热耐受性实验的结果没有显著影响，在该实验中，线虫被暴露于持续的 35 摄氏度温度下，并在不同时间点测量存活线虫的百分比。首次进行该技术操作时，务必用石蜡膜将培养板包裹两层，以防止水分进入培养板而破坏实验。分子检测可进一步扩展为利用 RNA-seq 进行基因组分析。

其他受热激反应影响的生物体水平检测也可包括在内，例如寿命测定。在秀丽隐杆线虫中，能够关联分子、细胞和生物体水平的热激反应检测，已被证明对于理解该通路在发育和疾病中的作用具有重要价值。