量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中利用组织特异性表达的多聚谷氨酰胺荧光报告基因具有重要意义，因为它能够在完整的多细胞生物背景下发现并表征蛋白稳态调节因子。该技术的主要优势在于，它能够实现对与年龄相关的细胞内蛋白稳态功能下降进行活体可视化和定量分析，这对于深入理解生物体如何维持蛋白质组的正确折叠与功能以及衰老的影响至关重要。阐明能够维持蛋白稳态的机制，将有助于开发针对蛋白稳态受损的衰老相关疾病的靶向干预措施，并促进健康衰老。

蛋白质稳态失衡是一个重大的临床问题，因为它与蛋白质错误折叠疾病的发生密切相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及肌萎缩侧索硬化症。首先使用直径为6厘米的培养皿，为每种测试条件制备五个琼脂平板。对于RNAi实验，需在转化后的HT115大肠杆菌中诱导dsRNA的产生，并使用含RNAi的琼脂平板。

在无需RNAi的实验中，使用标准NGM琼脂培养OP50大肠杆菌。将大肠杆菌培养物在37摄氏度、220 RPM振荡条件下过夜培养。次日，以2,400 G离心15至20分钟收集菌体，吸除上清液后，将菌体沉淀重悬于初始LB培养液体积的十分之一中。

将200微升浓缩细菌分装至每块培养板中，将敞口的培养板置于洁净环境中干燥，直至所有液体被吸收。为通过次氯酸盐处理同步秀丽隐杆线虫（C. Elegans），用M9缓冲液洗涤成年雌雄同体线虫两次，然后将其转移至新的离心管中，加入5毫升次氯酸盐溶液，振荡孵育5分钟，每隔1分钟振荡一次。孵育结束后，离心收集线虫，并用M9缓冲液洗涤三次。

将胚胎置于含有3毫升M9溶液的离心管中，在20摄氏度下旋转过夜，使其孵化。通过将10微升L1期幼虫溶液滴加到6厘米培养皿中三次，计数L1期幼虫的数量，以计算L1期动物的密度。定期混匀L1期溶液，防止动物沉降。

每块培养皿接种约50条L1期幼虫，计数并记录接种数量，然后将培养皿转移至20摄氏度培养箱中。或者，可通过产卵同步化动物：将5至10条年轻、怀卵的成虫放置于每块培养皿中，持续4至6小时，使其产卵直至每皿约有50枚卵。移除所有怀卵成虫，并将带有卵的培养皿转移至20摄氏度培养箱中。

将动物培养至L4期，约需在20摄氏度下培养40小时。随后加入50微升160倍浓度的FUDR。为检测肌肉组织中蛋白质稳态的下降情况，挑选20只动物，将其置于载玻片上，载玻片上预先放置3%琼脂糖垫，并加入5微升10毫摩尔叠氮化钠溶液。

所有线虫固定后，使用 10 X 倍率物镜对动物的整个身体进行成像。采用 FITC 或 YFP 滤光片，并对每个动物使用相同的曝光时间。完成后，弃置载玻片。

统计整个动物体壁肌肉中焦点的数量。焦点是比背景中较弱的可溶性信号更亮的点状信号，可与之区分。在评分当天，观察培养皿中的动物，记录瘫痪动物的数量，然后将瘫痪的动物从培养皿中移除。

实验结束后，计算每种条件下的麻痹率，并绘制麻痹进程曲线。为检测神经组织中蛋白质稳态的下降情况，按照前述方法将线虫置于载玻片上，使用40倍物镜在复式显微镜下对动物头部进行Z轴层扫成像。成像完成后丢弃载玻片。

获取图像后，将Z轴层叠图像进行压平处理，并用于量化位于神经环区域的神经元中的焦点数量。绘制第4、6、8和10天YFP焦点累积的变化趋势。在成虫期第二天，从培养皿中挑选10只同步发育的动物，置于载玻片上10微升M9缓冲液液滴中。

重复此步骤至少四次，以获得40只或更多动物的样本。使用具备摄像功能的体视显微镜，对动物的运动进行30秒的视频记录。当所有待分析动物的视频录制完成后，播放视频并记录每只动物的身体弯曲次数。

将每只动物的体节弯曲次数绘制成柱状图，其中每个点代表在 Y 轴上 30 秒内的体节弯曲次数，X 轴代表测试的不同条件。多聚谷氨酰胺重复模型在鉴定调控蛋白质稳态网络的基因方面发挥了重要作用。肌肉特异性表达 polyQ-YFP 会导致荧光焦点的积累，在简单的荧光解剖显微镜下易于定量。

动物在中年时期会因报告基因的蛋白毒性导致肌肉内蛋白质组崩溃而出现瘫痪。通过将动物放入液体后直接定量聚集物的形成以及协调性体弯的减少，可以追踪与年龄相关的神经元蛋白质稳态的下降。该方法已被用于证明同源结构域相互作用蛋白激酶（一种转录共调节因子）可通过调控自噬和分子伴侣的表达来影响衰老过程中的蛋白质稳态。

HPK-1的缺失会增加Q35-YFP聚集体在衰老过程中积累的数量。对照组动物平均有18个聚集体，而HPK1基因敲除突变体和HPK1 RNAi处理的动物平均分别有28个和26个聚集体。在成年第八天时，77%至78%的HPK1缺陷型动物出现瘫痪，而对照组仅有50%出现瘫痪。

此外，HPK1 的过表达被证明可调控蛋白质聚集体的形成，并在衰老过程中保护动物免受 Q35-YFP 相关麻痹的影响。该方法用于测量特定细胞类型内蛋白质组的整体衰退情况。目前已有多种方法可用于评估蛋白质网络中特定组分的变化。

它们共同提供了全面的图景。蛋白质稳态的下降是衰老的一个标志。这种方法使研究人员能够量化这种下降。

与基因分析结合时，它是一种强大的发现工具。