由上皮细胞和原代免疫细胞组成的用于危害评估的多细胞人类肺泡模型

这些个体化人源音频模型利用相关免疫细胞作为强大工具，用于预测包括纳米材料和已知药物在内的物质所引发的急性免疫反应。该医学模型结合人源上皮细胞与人源原代免疫游戏副本，以评估特定反应。使用新鲜或冻存的单核细胞为实验设计提供了灵活性。

大量研究表明，该模型有助于深入理解行为感知与免疫感知之间的星际通讯。本演示包含了研究该模型在细胞培养中个体特征所需的全部重要细节，以及用于重复实验的可视化操作指南。膀胱模型方案中的多个步骤较为复杂，需要特殊操作处理。

因此，这些步骤均展示了所有必需的细节，以便能够轻松遵循。从人血沉棕黄层中分离外周血单核细胞时，将收获的棕黄层袋内液体均匀分装至250毫升锥形管中。用PBS小心将每根管中的总体积补至250毫升，并轻轻倒置混匀三次。

然后将Buffy coat PBS溶液等分为四份，分别加入四个新的50毫升离心管中，每管加入10 µL CD14阳性磁珠，用于标记总细胞中的单核细胞，通过移液充分混匀。加样完成后，将移液管从移液器上取下，立即用拇指堵住移液管上端开口，将装有密度梯度介质的移液管插入其中一管底部，松开拇指使密度梯度介质缓慢流至Buffy coat PBS混合液下方，直至移液管中剩余1 mL密度梯度介质为止。以相同方式向每支离心管中添加密度梯度介质后，进行密度梯度离心以分离细胞，并使用血清移液管从血浆层与密度梯度介质层之间收集2至3毫米厚的白色外周血单个核细胞层。

连接该细胞层的最佳方法是先去除血浆，然后使用无菌移液器收集细胞。将每两管外周血单个核细胞转移至一个全新的50毫升离心管中，每次用总共50毫升新鲜PBS洗涤细胞，共洗涤两次。随后弃去上清液，将每管细胞沉淀用5毫升新鲜PBS重悬，再将所有细胞悬液汇集至同一管中进行细胞计数。

计数后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于每10⁷个细胞80毫升的磁分离缓冲液中。然后向管中加入每10⁷个总细胞10微升CD14阳性磁珠，用移液器充分混匀。在4°C孵育15分钟后，用3毫升磁分离缓冲液冲洗磁柱，然后将细胞加入柱中。

用三毫升缓冲液洗涤柱子三次，每次洗涤后将柱子转移至含有1毫升新鲜磁性分离缓冲液的15毫升离心管中。然后使用推杆和五毫升缓冲液将CD14阳性细胞冲洗到离心管中。不要诱导经磁珠分离获得的CD14阳性细胞发生分化。

首先，用细胞培养基将细胞重悬至浓度为每毫升1×10⁶个细胞。对于MDDC分化，在试管中加入10纳克/毫升的粒-巨噬细胞集落刺激因子，并将3毫升细胞加入6孔细胞培养板的每个孔中；对于MDM分化，则向细胞中加入10纳克/毫升的巨噬细胞集落刺激因子，并按上述方法接种细胞。为建立人肺泡上皮细胞-组织-三细胞共培养模型，首先将1.5毫升预热的细胞培养基转移至12孔板中适当数量的孔内，然后在每个孔中放入一个细胞培养小室。

随后，将500 µL上皮细胞悬液（密度为5 × 10⁵ 个细胞/毫升）加入每个插入式培养小室的顶端，盖好培养板，在细胞培养箱中孵育4天。或者，在用于MDDC分化的6孔板中进行MDDC接种：弃去各孔中的上清液，每孔加入1 mL新鲜的预温细胞培养基，使用细胞刮刀将贴壁细胞从各孔中刮下。用上清液洗涤每个孔3次，并将所有孔中的细胞悬液合并至同一个离心管中。

将收获的MDDC通过离心和无菌镊子操作，将12孔板中的小室倒置放入无菌培养皿中。从小室的基底侧刮除任何上皮细胞，并将MDDC重悬于新鲜细胞培养基中，调整细胞浓度至每毫升4.2 × 10⁶个细胞。然后向每个小室加入150 µL细胞悬液，确保小室整个基底表面均匀覆盖液体且无气泡产生。

在收获已分化的 MDDM 后，参照 MDDC 的接种方法，将细胞稀释至每毫升新鲜细胞培养基中含 2.5 × 10⁴ 个细胞的浓度，然后沿每个含有上皮细胞和 MDDC 的细胞培养小室的管壁缓慢加入 500 µL 细胞悬液，盖上培养板盖，将培养板放入细胞培养箱中培养 24 小时。次日，吸除每个细胞培养小室的顶侧和基底侧以及各孔中的上清液。然后使用灭菌镊子将小室从孔中取出，并向每孔中加入 600 µL 预先温育的新鲜细胞培养基。

经过六天的分化后，MDM 呈圆形，而 MDDC 则形成由形态更细长且具有可见突起的细胞组成的簇状结构。在膜插件上培养三天后，上皮细胞形成致密的单层。当基底室暴露于膜破裂的阳性对照时，细胞培养基中乳酸脱氢酶的释放量显著增加，证明该模型对细胞毒性物质具有响应性。而在顶侧用 TNF alpha 或 LPS 刺激时，未检测到乳酸脱氢酶释放量的增加。

与未处理的对照细胞相比，经LPS和TNF alpha处理的样本中IL6和IL8的释放量均显著增加。在使用新鲜外周血单核细胞来源的MDDM和MDDC的共培养模型与使用冻存细胞的共培养模型之间，细胞形态未见差异；但在LPS和TNF alpha暴露的共培养中观察到上皮层出现破坏。也可使用其他类型的人源细胞（如气道或细支气管细胞），并可分析其他终点指标。

研究人员主要受到该技术的启发，采用类似的实验设置，但使用了不同的细胞类型。