用于研究肺泡黏膜免疫反应的免疫活性肺泡芯片模型

我们建立了具有生理相关性的体外模型，以解答人类感染中的机制性问题。我们的研究重点是宿主的人体反应，利用该模型解析病原体与宿主之间复杂的相互作用，从而识别人类感染治疗策略中的分子和细胞靶点。类器官芯片模型（如肺芯片模型）在生物复杂性与特定研究需求之间取得平衡，为人类宿主反应的调控机制提供深入见解。

该系统模拟体内细胞组成和三维结构，相较于动物实验，可提供更明确的条件和更高的通量。在“器官芯片”肺模型技术中，主要挑战之一是选择能够模拟肺部复杂功能的合适细胞类型，以获得可靠的感染研究结果。此外，相较于传统的体外模型，延长实验时间至关重要。

利用连续的营养流维持细胞活性的能力称为“杠杆作用”（leveraging）。对于较长时间的观察，该实验也是必要的。我们开发了基于微流控技术的人肺泡模型，作为一种有效模拟人体肺泡环境的工具。

通过灌注模拟血流，并对内皮细胞施加机械刺激，同时通过将上皮细胞暴露于空气中，整合气液界面，从而实现了这一目标。下一步是将该模型扩展到更先进的平台，例如基于诱导多能干细胞的模型。通过这种方式，我们旨在推动个性化医疗更接近实际应用，特别是在抗病毒药物测试以及生物医学研究和药物开发领域。

首先，将 Biochip 型号 BBC002 置于玻璃培养皿中，用无菌 70% 乙醇冲洗所有腔室 45 分钟。随后，用无菌双蒸水冲洗腔室两次。使用带有蓝色吸头的 1000 微升移液器，将无菌的 IV 型胶原溶液涂覆于上腔室的 Biochip 膜上。

将芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，用含有镁和钙的无菌PBS冲洗上腔和下腔各两次。每个腔室的上腔加入250微升含青霉素-链霉素的内皮细胞（EC）培养基，下腔加入150微升。

用 5 毫升不含镁和钙的 DPBS 缓冲液洗涤 T-25 培养瓶中汇合的人脐静脉内皮细胞。加入 1 毫升含 0.25 胰蛋白酶和 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS 溶液，在 37 摄氏度孵育 3 分钟。孵育结束后，加入 5 毫升 PBS 和 5% FCS 以终止胰蛋白酶活性。

在50毫升的锥形管中，以350 ×g离心5分钟，收集沉淀，并将沉淀重悬于1毫升EC培养基中。取10微升1至10倍稀释的细胞悬液，加入含有10微升台盼蓝染液的微量离心管中。使用血细胞计数板（Neubauer计数室）手动计数细胞。

计数后，将生物芯片上室中的内皮细胞培养基更换为200微升含有0.4×10⁶个人脐静脉内皮细胞的EC培养基。将装有生物芯片的玻璃培养皿置于37°C、5%二氧化碳环境中。每天更换培养基，上室加入300微升EC培养基，下室加入200微升RPMI+培养基。

用一毫升 PBS 洗涤单核细胞后，将其在含有利多卡因和 EDTA 的预热 PBS 中于 37 摄氏度及 5% 二氧化碳条件下孵育 7 分钟。收集细胞并在 350 ×g 离心 7 分钟。用一毫升 RPMI+ 重悬后，按先前所示方法计数细胞。

在下室中加入200微升RPMI+培养基，其中悬浮0.1×10⁶个单核细胞。将Biochip的端口朝下放置，使细胞贴附于膜上。在将已灭菌的管路连接至Biochip之前，先用200微升PBS冲洗管路，随后再用200微升EC培养基冲洗。

用新配制的细胞培养基冲洗上室和下室后，将储液槽插入生物芯片的出口侧，并用管路将储液槽连接至生物芯片的入口。为实现培养基的循环灌流，需将管路连接储液槽和生物芯片。随后向储液槽中加入 500 µL 内皮细胞培养基。

将生物芯片与管路连接，以每分钟21微升的流速开始灌注。第二天，停止灌注并排空储液槽。在无菌安全柜内，用移液器向储液槽中加入500微升EC培养基，并用200微升RPMI+培养基轻轻冲洗下腔。

然后以每分钟21微升的流速重新开始灌注。从第12天到第14天建立气液界面时，打开下腔室的塞子，小心吸去培养基，直至观察到气泡出现。确认微通道和腔室中的液体完全移除后，小心关闭端口。

向储液器中加入新配制的血管内皮细胞培养基，并仅在上腔室中继续灌注培养至第14天。将生物芯片从流体系统中断开。移除导管后，在显微镜下观察生物芯片中的细胞层，检查细胞融合度。

用 PBS 清洗生物芯片腔室，以去除细胞培养基。向顶部腔室加入 300 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，向底部腔室加入 200 微升。孵育 10 分钟后，用 PBS 清洗腔室三次。

进行透化处理时，在 PBS 中加入 300 微升 0.25% Triton X-100，孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤后，向两个腔室中各加入 300 微升含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液，孵育 1 小时。进行免疫荧光染色时，使用 3% BSA 按适当的稀释比例为每张膜分别配制 50 微升抗体溶液。

为了获取生物芯片腔室内的细胞，需在腔室外部进行精确切割，并移除封接箔。使用手术刀切除与生物芯片密封边缘相连的膜，并将膜完整取出。将膜分割成两部分后，用镊子收集膜片，置于显微载玻片上以进行染色。

向每块膜加入 50 微升抗体溶液，在 4 摄氏度避光条件下孵育过夜。用 PBS 洗涤膜三次后，在标记的载玻片上滴加一滴封片液，并放置相应的膜。在膜的上方再滴加一滴封片液，然后盖上盖玻片。

人脐静脉内皮细胞的免疫荧光染色显示，共培养14天后细胞形态发生改变且标志蛋白表达发生变化。在血管侧，内皮细胞边界处VE-cadherin的表达提示细胞融合及内皮屏障的形成。在上皮侧检测E-cadherin和表面活性蛋白A的表达，以评估肺泡上皮的完整性和功能。