利用纳米流体技术在单个及批量 C. elegans 样本中进行高通量定量 RT-PCR

本方案通过直接对单个或少量样本进行RT-qPCR检测，无需RNA提取步骤，显著提高了通量和时间效率。采用本方案，仅需两天的实验操作即可获得超过9,000个RT-qPCR结果，而使用标准96孔qPCR方法通常需要约五周时间。该方案在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中提供了一种更快、更稳健且高度灵敏的RT-qPCR检测方法，非常适合监测同基因型线虫个体间基因表达的差异。

首先将线虫从其细菌菌苔中挑取至新鲜的未接种线虫生长培养基平板上，让线虫在平板上移动约五分钟。在线虫适应环境的同时，在无RNase的超净台内，将每个样品中10微升裂解缓冲液与1至100单位的DNase I混合，并将PCR条状管盖倒置于解剖显微镜的载物台上。随后，向凸起的PCR管盖中加入10微升裂解混合液，并从平板上挑取线虫，注意避免将细菌带入盖子的每个凹槽中。

当所有蠕虫转移完毕后，盖紧管盖，将离心管涡旋振荡五秒钟，随后放入液氮杜瓦瓶中。最后一次振荡五秒后，将离心管置于40摄氏度水浴中解冻，然后重复冻融过程九次。完成最后一次冻融循环后，将裂解的样品置于4摄氏度、约1800转/分钟的温控混匀仪上混合20至30分钟。

混合孵育结束后，按演示方法离心样品，并向每根试管中加入1微升 freshly thawed终止液。对于大量温热样品的逆转录，在无RNase的超净台中配制酶缓冲液预混液，将14微升预混液加入到每份11微升的样品中。使用指定的逆转录程序在热循环仪中运行样品，并将所得的cDNA产物用无核酸酶水按1:4的比例稀释。

对于靶向特异性预扩增，在96孔板中每个样本的一个孔内加入3.75 µL预扩增主混合液，并向每孔主混合液中加入1.25 µL的cDNA溶液。当所有样本加样完成后，用封板膜封住板子，短暂涡旋混匀后离心沉降样本，然后将板子放入热循环仪中，按指定程序运行。为去除预扩增中未掺入的引物，在热循环结束后对样本板进行离心，并小心移除封板膜。

向每个预扩增反应中加入2 µL外切酶I主混合液，重新密封后离心，并将板放回热循环仪中。循环结束后，用18 µL Tris-EDTA缓冲液稀释样品。为设置多阵列芯片，在384孔板中每个样品的一个孔内加入3.6 µL检测加载主混合液和0.4 µL 50 µM的正向与反向引物。

然后，向孔板中相应的孔加入 2.2 µL 样品主混合液和 1.8 µL 经核酸外切酶 I 预扩增处理的各样品。为制备单阵列芯片，在第二个 384 孔板的每个样品孔中加入 5.4 µL 检测加载主混合液和 0.6 µL 正向反向引物，然后向已制备的单阵列板的相应孔中加入 3.3 µL 样品主混合液和 2.7 µL 经核酸外切酶 I 预扩增处理的各样品。首次运行时为启动纳米流体芯片，将芯片保持在 45 度角，缓慢而小心地向芯片的蓄液池中注入 150 µL 控制线液体。

当所有液体加样完成后，从芯片底部移除蓝色保护膜，并将芯片放入纳米流体 PCR 预启动仪中，条形码朝外。然后运行 Prime(153x) 程序。预启动完成后，将芯片置于深色表面上，根据实验方案，当每个检测或样品混合液加样时，必要时移除相应的屏障塞，并将适当体积的检测液或样品混合液加入纳米流体芯片对应的入口。

上样后，将芯片放入纳米流体热循环仪中，并在数据采集软件中运行相应的程序。如果未使用整个多阵列芯片，需执行脚本后运行，以便后续使用芯片上剩余的阵列。为了验证从线虫到Ct值的实验方案是否为一种有效的cDNA提取方法，将其与标准的硫氰酸胍-酚-氯仿提取法进行了比较。

全球范围内，使用苯酚-氯仿法和直接虫体至Ct法时，每100纳克总RNA中hsp-70 mRNA的表达水平相当。然而，在hsp-70表达最高的情况下，直接虫体至Ct法检测到的表达水平更高，表明其灵敏度更优。对于大量样本的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法，与对照组相比，hsf-1突变体中hsp-70的表达下降了82.7；而采用温育至Ct法时下降了92.3%，表明两种方法检测到的表达下降程度相近。

利用从25条线虫的混合样本或平均36个单条线虫样本中获得的cDNA，该方法检测到所有测试伴侣蛋白的表达水平具有可比性，表明从单条线虫获得的参数是可靠的。此处展示了单条线虫在短暂热激后多个hsp转录本的平均表达水平。如图所示，不同基因间转录本表达的变异性差异显著。

对于使用单条线虫样本检测的每个转录本，技术重复的变异系数均低于生物学重复的变异系数，表明在对单条线虫进行qPCR检测时，无需进行技术重复即可用于参数估计。在执行本方案时，必须准确移取小体积液体，并且不得将液体反向吸入纳流控芯片中。本方案可用于获取大规模的RT-qPCR数据集，随后可根据需要导出并使用Excel或R脚本进行处理。