零模波导的制备用于高浓度单分子显微镜观察

本文介绍的用于制备零模波导的纳米球光刻方案是一种简便且低成本的方法，无需任何专用的加工设备或设施。该方法将有助于单分子生物物理学研究，并使更多研究人员能够在与生物学相关的荧光试剂浓度下开展单分子实验。为了为胶体颗粒的蒸发沉积提供一个洁净的表面，需将光学级硼硅酸盐玻璃盖玻片放入考普林玻璃染色瓶的带槽插入件中。

向染色缸中加入足量丙酮，以浸没盖玻片，并盖上缸盖。在 40 摄氏度下超声处理 10 分钟。倒出丙酮，并用蒸馏水将盖玻片冲洗三次。

重复超声处理和丙酮清洗后，向容器中加入足量氢氧化钾以浸没盖玻片。盖上盖子，在40摄氏度下再次超声处理20分钟。用蒸馏水冲洗盖玻片六次，然后在40摄氏度下于乙醇中超声处理10分钟。

用蒸馏水将盖玻片清洗三次后，用镊子轻轻夹住每片盖玻片的边缘。用氮气吹干每片盖玻片，并将每片洁净干燥的盖玻片放入各自的培养皿中。离心50微升1微米的非功能化聚苯乙烯微球。

弃去上清液，尽可能减少残留的水分。将珠子重悬于50 µL溶剂中，然后用移液器充分混匀。为沉积设置湿度室，将六个培养皿排成一行。

在每个培养皿中放置一片盖玻片，并将皿盖略微打开，使盖玻片暴露于环境中。在培养皿后方中央位置放置一个湿度计和一个小型电风扇，然后记录实验室内的相对湿度。取一个200毫升的烧杯，加入150至200毫升、温度约为75摄氏度的水，将烧杯置于风扇后方。

打开风扇，然后用一个倒置的透明塑料收纳盒将培养皿、风扇、烧杯和湿度计盖住。当相对湿度达到70%至75%时，略微抬起塑料收纳盒，并迅速盖上培养皿的盖子，以防止盖玻片过度湿润。当密闭容器内的相对湿度达到85%时，用移液器将5 µL微珠悬浮液滴加到每片盖玻片的中央。

每次沉积后立即盖上每个培养皿，并在沉积间隔期间始终保持储存容器处于加盖状态。应尽快完成微珠沉积，以尽量减少湿度损失。若沉积物过干或过湿，应优先优化培养室的湿度。

当所有六次沉积完成后，记录腔室内的相对湿度，并让液滴在载玻片上铺展并干燥五分钟。为提供一个温度均匀的表面以退火聚苯乙烯微球，将一块平整的铣削铝板放置在标准陶瓷加热板上，并将加热板温度设定为107摄氏度，即聚苯乙烯的玻璃化转变温度。将含有微球模板的盖玻片放置在加热的铝板上。

退火20秒后，将盖玻片从铝板上取下，并迅速放置在室温的铝表面上进行冷却。采用热蒸发沉积法，在含有微珠模板的盖玻片上以每秒2埃的速率沉积300纳米厚的铜层。这将在微珠之间的间隙中形成柱状结构。

为了去除珠子上多余的铜，轻轻将一片胶带贴在表面，然后缓慢揭下胶带。将盖玻片放入甲苯中并静置过夜，以溶解聚苯乙烯珠子。小心操作盖玻片，先用氯仿冲洗一次，再用乙醇冲洗两次。

用氮气吹干模板。将模板放入氧气等离子体清洗机中处理30分钟，以去除残留的聚合物和污染物。采用热蒸发沉积法，以每秒一埃的速率沉积三层纳米厚的钛作为粘附层，然后以每秒四埃的速率在铜柱周围及顶部沉积100至150纳米厚的铝层。

确保样品在沉积过程中不发生旋转，某些沉积设备会自动执行旋转操作，需避免。为溶解铜柱，将盖玻片浸泡在铜刻蚀液中两小时。用去离子水冲洗盖玻片后，用氮气吹干，然后用镜头纸轻轻擦拭表面，以暴露仍被包覆层覆盖的铜柱。

将盖玻片继续浸泡在铜刻蚀液中两小时，然后用蒸馏水再次冲洗，并用氮气吹干。表面钝化后，可通过双面胶带将零模波导盖玻片与石英载玻片配对，制成用于单分子成像的微流控流动池。胶体模板自组装的成功与否在很大程度上取决于相对湿度。

在结构良好的模板中，微珠区域呈圆形，其边界由不透明的多层环定义。在结构良好的模板中，大多数模板应包含六方密堆积的微珠。由于蒸发沉降过程中的堵塞效应，晶粒之间会存在一些缺陷。

在铜沉积并溶解聚苯乙烯微球后，铜柱的直径应小于150纳米。当铜沉积深度为300纳米时，铜柱高度约为250纳米。在沉积铝包层并随后溶解铜柱后，应可通过原子力显微镜观察到波导结构，且波导间距约为550纳米。

将聚苯乙烯模板退火20秒，可制备出直径为118纳米的铝制波导，该尺寸足够小，可阻断可见光的传播。用于成像的零模波导（ZMW）典型区域在40乘80微米的视场内包含3,000个波导。通过单分子FRET实验检测ZMW的功能性。

在所有测试的环境浓度下，均可检测到单分子FRET信号。相比之下，使用TERF照明时，仅在皮摩尔至低纳摩尔浓度范围内才能检测到单分子信号。在零模波导制备完成后，可利用聚合物对器件进行钝化处理，以减少单分子成像过程中的非特异性相互作用。

零模波导的玻璃底部也可进行轻微蚀刻，以增强单分子发射。总体而言，这种新型的零模波导制备方法将使研究人员能够更便捷地研究接近细胞内浓度和速率的动态生物化学过程，例如转录或翻译。