基于光子芯片的高通量全内反射荧光与直接随机光学重建显微技术

本文的主要目标是介绍一种新开发的基于光子芯片的全内反射荧光显微成像技术以及单分子定位显微成像技术（如dSTORM）的成像流程。其中的核心组件是光子芯片，该芯片由一系列光学波导构成。光学波导内的光通过全内反射进行传导。

部分光以隐逝波的形式存在于表面。这些隐逝波从表面开始呈指数衰减，穿透深度为几百纳米。这使得它们适用于全内反射荧光（TIRF）照明。

通过光波导实现的全内反射荧光（TIRF）照明覆盖范围极广，其照明区域由波导的几何结构决定，因此非常适用于高通量成像。与传统的TIRF和dSTORM装置相比，我们的方法关键区别在于使用光子芯片对样品进行照明，而非通过成像物镜导入光线。我们的方法将照明光路与信号收集光路分离，从而开辟了新的成像可能性。

使用晶圆镊子将芯片放入玻璃培养皿中，并用1% Hellmanex溶液完全覆盖。将培养皿置于70摄氏度的加热板上加热10分钟。在加热板上时，用洁净室擦拭纸轻轻擦拭芯片表面。

从培养皿中取出芯片。用至少100毫升去离子水冲洗。再用至少100毫升异丙醇冲洗，注意避免溶剂在表面干燥，以防止蒸发残留痕迹。

用至少 100 毫升去离子水冲洗。用氮气枪吹干芯片。通过在培养皿中旋转制备一层 150 微米厚的 PDMS。

使用手术刀从PDMS层上切割出一个约1.5 × 1.5厘米的框架。用镊子将该框架从培养皿中轻轻提起，并平整地放置在洁净且抛光的芯片上。

样品现已准备好用于细胞接种。细胞接种后，将芯片从培养基中取出。使用移液枪吸去PDMS腔室外侧的多余液体。

使用移液器从PDMS腔室中移除当前液体，同时加入约60 µL的洁净PBS。用60 µL洁净PBS替换原有液体，孵育1分钟。重复上一步骤，此次孵育5分钟。

吸除 PBS，加入 60 µL 染料溶液。将样品避光孵育约 15 分钟。使用前述步骤用 PBS 清洗样品。

吸除 PBS，并同时替换为 40 微升成像缓冲液。盖上盖玻片，避免盖玻片下方产生气泡。轻轻按压盖玻片，使其与成像腔贴合，以去除多余的液体。

使用移液器除去盖玻片外多余的培养基。用蘸水的棉签清洁盖玻片外部区域，以避免浸油残留物干燥后形成结晶。该版本的装置由三个主要组件构成。

配备滤光片架、白光光源、相机和物镜转盘的显微镜。耦合平台，即三轴压电平台，带有光纤耦合激光器和耦合透镜。样品平台，即单轴手动平台，带有倾斜和俯仰调节功能，并配有真空样品 holder。

耦合器和样品台均安装在双轴电动平移台上，用于样品的移动。将芯片放置在真空吸盘上，使耦合端面朝向耦合物镜。确保芯片与耦合物镜之间的距离约为一个焦距。

打开真空泵。将激光器开启至一毫瓦。粗略调节芯片高度，使光束照射到其边缘。

关闭激光器。打开白光光源。选择低倍物镜，例如 10x。

将显微镜聚焦于波导上。沿波导移动显微镜，检查其是否与光路良好对准。将显微镜移至耦合边缘。

将激光器开启至一毫瓦或更低功率。沿耦合边缘移动显微镜以找到激光光斑。将光束聚焦在芯片边缘上。

沿光路方向调节耦合装置，使激光光斑尺寸减小直至消失。此时光束位于芯片表面之上或之下。调节耦合装置的高度，直至光斑重新出现并达到最大。

重复前两个步骤，直到激光形成聚焦光斑。将聚焦光斑移动至目标波导处。轻微平移显微镜，使其远离边缘，直至聚焦光斑不再可见。

关闭白光，调节对比度。如果波导正在导光，则应能清晰看到沿波导散射的光线。

调整耦合装置的轴向以最大化散射光强度。关闭激光器。打开白光光源。

如有必要，调整对比度。导航至成像区域，使用所需的成像物镜进行聚焦。

关闭白光，插入荧光滤光片，并将激光功率调至1毫瓦。将相机曝光时间设置为约100毫秒。

根据需要调整对比度。确保耦合仍处于最佳状态。找到用于成像的感兴趣区域。

打开压电载物台循环以平均化节点。采集至少300张图像。使用虚拟堆栈将采集的图像序列加载到Fiji中。

在 Fiji 的图像菜单中，选择“Stacks”（堆栈），然后选择“Z Project”（Z 投影）。通过选择投影类型为“Average Intensity”（平均强度）来计算 TIRF 图像。将激光功率调至一毫瓦，并将相机曝光时间设置为 30 毫秒。

调整对比度和焦距。逐渐增加激光功率，直至观察到闪烁现象。对样品的微小区域进行放大。

调整对比度。拍摄几张图像，检查荧光闪烁是否充分分离。调节相机的曝光时间以获得最佳的闪烁效果。

打开压电载物台循环。根据闪烁密度记录至少 30,000 帧的图像序列。启动 Fiji，将 dSTORM 图像序列作为虚拟图像加载。

如有必要，调整对比度。使用矩形工具选择需要重建的区域。在 Fiji 中打开 ThunderSTORM 插件的“运行分析”功能。

在 ThunderSTORM 中设置与您的设备相对应的基本相机参数。其余默认参数通常已足够适用。开始重建。

通过重建软件提供的定位列表经过滤以去除非特异性定位。如有必要，可进一步应用额外的漂移校正。基于芯片的成像与传统成像之间的主要区别在于仪器设备和数据采集方式。

因此，重建图像的质量可采用与商业超分辨率显微镜图像相同的方式进行评估。然而，由于使用了多模波导，若采集的图像数量过少，最终图像可能会出现激发不均匀的现象。这一点在图 a 中有所展示。

增加激发光模式的数量会导致激发不均匀，如图 b 所示。此处我们对肝窦内皮细胞进行了成像，其质膜经荧光标记。图 a 和图 b 均为衍射受限图像。

图c显示了图b插图区域的衍射极限图像。图d显示了同一区域的dSTORM图像。肝窦内皮细胞的质膜上具有纳米级的窗孔结构，这些结构在图d的超分辨率图像中清晰可见。

基于芯片的超分辨率成像主要优势之一是能够实现较大的视场。图 a 显示了肝窦内皮细胞的 500 微米 × 500 微米大小的 dSTORM 图像，其中微管蛋白经荧光标记。图 b 显示了图 a 中品红色插入区域的放大图，同时展示了衍射受限图像与超分辨率图像，以便进行对比。

图c展示了图a中的绿色插图区域。所捕获图像的分辨率为77纳米。在本视频中，我们利用光子芯片作为照明光源，对肝窦内皮细胞进行了大视野的全内反射荧光（TIRF）和直接随机光学重建显微（dSTORM）成像。

我们的方法比使用预定数值孔径和小视场物镜的传统全内反射荧光（TIRF）技术更简单、更紧凑且更灵活。我们已利用光子芯片探索了多种超分辨率成像技术，其中就包括定位显微镜（如dSTORM）。例如，与使用成像物镜相比，光可在高折射率的光波导材料内部实现更为紧密的限制。

芯片照明的这一特性已应用于提高基于强度波动的光学显微技术以及结构照明显微技术的分辨率。此外，光子芯片还具有微型化、成本低和光学系统简单的优势。作为一种集成技术，它可与其他片上光学功能相兼容。

总之，这使得对传统的衍射极限显微镜进行改造成为可能，从而以较低的成本实现超分辨率成像。