监督式机器学习用于肾小球肾炎中细胞外DNA的半定量分析
2020年6月18日
细胞死亡过程中释放的细胞外DNA（ecDNA）具有促炎性，并参与炎症反应。在损伤部位检测ecDNA可评估靶器官中治疗干预的效果。本方案描述了利用机器学习工具对肾组织中ecDNA的定量进行自动化测量的方法。
肾小球肾炎可导致病理性肾小球损伤，伴随大量细胞死亡和细胞外DNA释放。本方案可实现对病理损伤过程中细胞外DNA释放位点的可视化。该技术的优势在于能够检测肾脏中因细胞死亡所释放的细胞外DNA。
与血清或尿液不同，细胞外DNA的检测是病理损伤的一种替代性标志物。该方法的意义在于，细胞外DNA染色及图像分析均可便捷地应用于其他自身免疫性疾病，如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮。该方法需要具备肾脏组织学的基本知识。
为了准确检测肾小球的细胞外DNA，研究人员必须能够正确识别肾小球。进行细胞外DNA染色时，首先将待测样本置于载玻片架中，在60摄氏度下加热60分钟，然后在通风橱内将载玻片浸入溶剂中，每次40分钟，共更换两次溶剂。第二次浸泡后，用100%乙醇处理两次、70%乙醇处理一次，每次五分钟，以使样本复水。
最后一次处理后，用镊子将切片放入高压锅中的煮沸抗原修复液内，高温加热10分钟。抗原表位暴露后，将高压锅从热源上移开并立即在水槽中用冷水冲洗锅盖表面。随后让切片在抗原修复液中平衡20分钟，再将样本置于0.01摩尔PBS溶液中，于旋转摇床上清洗两次，每次5分钟。
第二次洗涤后，使用疏水性笔在肾组织样本周围画圈，并加入60 µL含10%鸡血清的5%牛血清白蛋白溶液，在室温下封闭非特异性染色30分钟。孵育结束后，在湿盒中用60 µL目的一抗溶液替换封闭液，于4°C过夜孵育。次日早晨，在轨道摇床上用PBS洗涤切片，每次2分钟，洗涤后每张切片加入60 µL相应的荧光标记二抗溶液，在室温下孵育40分钟。
孵育结束后，按照演示方法用 PBS 洗涤载玻片，随后用含 70% 乙醇的 0.3% 苏丹黑处理，以淬灭可能由甲醛引起的自发荧光。30 分钟后，用自来水洗涤载玻片以去除任何沉淀物，并将载玻片浸入 PBS 中 10 分钟，防止进一步形成苏丹黑沉淀。孵育结束后，将载玻片用三滴每滴 60 µL 的封片液（含 DAPI）封固于共聚焦显微镜用盖玻片上，并用指甲油密封盖玻片。
将载玻片在室温下固化24小时。按照标准方案，将其在4°C避光保存，直至进行共聚焦激光扫描显微成像。务必用指甲油密封盖玻片，以防止成像过程中发生移动，并用乙醇清洁盖玻片，以提高成像分辨率。
每张切片成像 20 个肾小球后，在 ImageJ 中打开可训练的 Weka 分割插件，并将第一张图像拖放到 ImageJ 工具栏上。点击图像、颜色，然后分离通道。此时将显示显示一抗染色的图像。
要创建单个图像的合并文件，请点击颜色并合并通道。此时将弹出一个对话框，要求为每个通道分配一种颜色。勾选“创建复合图像”和“保留源图像”选项，然后点击“确定”。一个合并后的复合图像将会显示。
以一抗染色作为参考，在肾小球毛细血管丛周围绘制感兴趣区域。要对单通道蓝色 DAPI 图像执行高斯模糊，请点击 process（处理）、filters（滤镜），然后选择 Gaussian blur（高斯模糊），将模糊值设置为 1 至 2。
图像会略微模糊，但细胞核将呈现平滑状态，背景也会被柔化。接下来，点击插件、分割和可训练的Weka分割工具，使用自由手绘工具勾勒完整的细胞核。当所有感兴趣的细胞核均已被添加后，将其归入类别一框中，然后使用线条工具将背景区域划分至类别二框中。
单击“创建新类别”，使用线条工具勾勒经 DAPI 染色的核外 DNA 轮廓。单击“训练分类器”以获取概率图。切换鼠标以获得所有组分的黑白图像，其中所选对象以白色高亮显示。
要复制此图像，请单击图像并进行复制。在图像下方，调整并设置阈值。使用鼠标按钮调整阈值，直到仅观察到细胞外DNA为止。
阈值处理后，依次点击“Process”（处理）、“Binary”（二值化）和“Make Binary”（生成二值图像），并复制先前生成的肾小球感兴趣区域。按 Ctrl+Shift+E 选择“Edit”（编辑）、“Selections”（选择）和“Restore”（恢复），以恢复选定区域。为仅测量肾小球内的细胞外DNA颗粒，点击“Analyze Particles”（分析颗粒）并确认。系统将生成一个结果表，显示颗粒数量、面积、平均像素值以及含有细胞外DNA的肾小球百分比。
要将分类器保存为细胞外DNA分类器，请点击“保存分类器”并保存数据。若要在后续图像中重新应用该模型，请重复初始的图像处理步骤，然后选择“加载分类器”及已保存的分类器文件。日志菜单将弹出并运行该模型。
模型运行完成后，单击“加载数据”并选择 extracellularDNA.arff 文件，然后单击“创建结果”。如果生成的图像未能识别出所有细胞核、背景或细胞外DNA，请单击“重新训练分类器”，并根据需要添加更多分类器。
此处展示了代表性的 DNA 和 β-肌动蛋白染色的单通道图像。将两幅图像合并后，可围绕肾小球区域绘制感兴趣区域，以使用可训练的 Weka 分割方法测量小鼠肾小球内的细胞外 DNA，如图所示。该模型可用于识别对照患者肾活检标本中的细胞外 DNA，或与髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎患者的肾活检标本进行比较。
此外，该程序还可应用于肾脏组织样本中的其他染色，例如用于染色中性粒细胞胞外诱捕网以及在抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎中胞外髓过氧化物酶的沉积。重要的是，当多个用户分析相同数据时，未观察到显著差异。分析中最关键的步骤是为Weka分割程序提供足够多的背景、细胞核以及带有肾小球的胞外DNA示例，作为分类器的学习样本。
该方法易于转移应用。例如，可通过针对凋亡或坏死标志物的特异性抗体染色，进一步分析不同类型的细胞死亡。我们的技术也可用于其他炎症过程的研究，例如在自身免疫性肾病中评估 TLR 表达，或在人类肾活检组织中检测细胞外髓过氧化物酶的表达。
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概述
该方案可实现对肾脏组织中细胞死亡时释放的细胞外DNA（ecDNA）的可视化，这对于理解病理性肾小球损伤至关重要。该方法能够将ecDNA作为肾脏损伤的替代标志物进行检测，从而为评估治疗效果提供依据。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 病理学
背景
- 肾小球肾炎可导致显著的细胞死亡和胞外DNA（ecDNA）释放。
- ecDNA具有促炎性，可促进炎症反应。
- ecDNA的检测可用于评估治疗效果。
- 该技术适用于其他自身免疫性疾病。
研究目的
- 在肾脏损伤释放位点可视化染色体外DNA（ecDNA）。
- 确立ecDNA作为病理性损伤的标志物。
- 提供一种可适用于其他疾病状态的研究方法。
使用的方法
- 肾脏组织中ecDNA的可视化。
- 用于定量ecDNA的图像分析。
- 需具备肾脏组织学基础知识。
- 应用机器学习工具实现自动化。
主要结果
- 成功实现肾组织中ecDNA的可视化。
- 证实了ecDNA水平与肾损伤之间的相关性。
- 该方法可推广应用于其他自身免疫性疾病。
- 提供了一种可靠的替代标志物用于评估损伤程度。
结论
- ecDNA 测定是理解肾脏病理学的有力工具。
- 该技术可增强治疗监测效果。
- 在自身免疫性疾病研究中具有广泛的应用前景。
常见问题
行业应用价值
本方案可实现对福尔马林固定石蜡包埋肾组织中细胞外DNA（ecDNA）的客观、自动化定量，填补了在病理损伤部位直接测量细胞死亡的关键空白。通过采用可训练的Weka分割技术进行图像分析，该方法减少了人工标注的工作量，并提供可重复的定量结果，有助于在自身免疫疾病模型中进行机制性风险评估。该方法通过将ecDNA释放与肾小球肾炎中的特定细胞死亡通路（凋亡、坏死、中性粒细胞胞外诱捕网NETs）相联系，提高了靶点验证的可信度，对生物标志物开发和临床前疗效评估具有转化应用价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化疾病模型中作为肾小球细胞死亡直接读数的胞外DNA（ecDNA），实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过区分健康与病变组织之间的ecDNA水平，支持功能靶点的验证，明确作用机制。
- 预测价值：在临床前血管炎模型中生成定量数据，用于评估靶点结合效应及生物学风险降低情况。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：可生成标准化的定量输出结果（颗粒数、面积、肾小球阳性百分比），适用于高内涵筛选的适应性。
- 可重复性：在提供足够训练样本的情况下，不同用户之间无显著差异，支持检测的稳健性。
- 可扩展性：训练后的分类器可应用于后续图像，实现批量处理，减少大规模研究中的手动干预。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在小鼠模型和人源FFPE组织活检中提供一致的ecDNA检测方法，架起基础发现与临床前验证之间的桥梁。
- 生物标志物一致性：ecDNA作为与疾病相关的肾损伤替代标志物，与ANCA相关性血管炎中的病理生理过程相一致。
- 风险校正决策：实现不同治疗组间ecDNA水平的客观比较，为药物研发中的“推进/终止”决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从发现到临床前研究的连续过程，支持早期发现阶段的假设验证，实现筛选过程中标准化检测方法的部署，并为转化决策提供定量分析数据。
- 发现生物学：通过在肾小球肾炎模型中将胞外DNA（ecDNA）的释放与特定的细胞死亡机制（如NETosis、凋亡）相联系，促进信号通路的阐明。
- 筛选：生成标准化的、基于图像的定量读数，支持实验的可重复性以及化合物效应的评估。
- 分析：提供可量化的输出指标（如ecDNA颗粒面积、数量、肾小球占据率），实现不同实验条件之间的比较分析。
- 转化研究：通过在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中保守性地检测ecDNA，支持从小鼠肾炎模型到人类肾活检分析的连续性研究。
- 企业级复用：可训练的Weka分类器是一种可复用的资源，可适应于除初始ecDNA应用之外的其他器官和染色类型（如NETs、ecMPO）。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在靶器官中提供客观的、具有空间分辨能力的ecDNA定量分析，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：利用机器学习驱动的图像分割技术，增强实验的可重复性与标准化水平，最大限度降低因操作者差异带来的变异性。
- 战略价值：为临床前血管炎研究项目提供定量的、与机制关联的生物标志物，提升“推进/终止”决策的可信度。
- 项目组合影响：基于ecDNA调控在疾病相关体系中的有效性，实现对靶点的风险校正后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备肾脏组织学的专业知识，以准确识别肾小球并定义感兴趣区域。
- 依赖共聚焦成像设备以及安装有可训练Weka分割插件的ImageJ软件进行分析。
- 需要在不同实验室之间对染色、抗原修复和自发荧光淬灭步骤进行标准化。
- 需要足够的训练数据（背景、细胞核、ecDNA示例）以构建可靠的分类器，实现准确的分割。
- 仅限于二维图像分析；z轴层扫或三维ecDNA定量需要额外的验证。
