智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的应用及抗菌耐药性幼虫指数

本方案介绍了一种多层次的方法，可用于EST检测和噬菌体成像。该方法还引入了大样本索引，以保存并比较不同控制技术下的EMR水平。这种经济高效的技术具有智能化、高通量和多功能的特点。

该方法已促成兽医监测网络VAMS的建立，该网络已收集了20,000个流行病相关基因及分析性噬菌体。此方法还可用于医学、农业、动物养殖业以及渔业中致病菌的监测与控制。本实验方案及该公司论文应能提供有效的支持。

我们提供技术培训指南。遵循该指南可帮助任何人短时间内掌握该技术。首先，在穆勒-欣顿琼脂平板上孵育质控菌株大肠杆菌（E.coli）和93株测试沙门氏菌。

接下来，将每种菌株制备好的接种物稀释10倍。将200微升无菌生理盐水加入96孔板的a-1孔中作为阴性对照。然后分别将大肠杆菌（E.coli）的两种悬液用移液器加入a-2和a-3孔中，作为阳性对照和质控对照。

向其余93个孔中各加入200微升稀释后的测试菌株。制备抗菌琼脂平板时，首先根据LAR指数设定所测试的不同抗菌剂的浓度范围。

按照 CLSI 标准琼脂稀释法，对抗生素溶液进行两倍系列稀释。然后将 2 毫升抗菌溶液加入已灭菌的玻璃瓶中，瓶内含有 18 毫升熔化的 Mueller-Hinton 琼脂培养基。充分混匀后，在生物安全柜内倒入培养皿中。

在室温下让琼脂凝固。确保培养皿盖下留有缝隙，以利于琼脂表面干燥。在培养皿底部标记抗菌剂的种类及其相应浓度。

将每种抗菌剂的多个孵育平板按2倍对数稀释顺序叠放成堆。最后，为每种抗菌剂准备两个不含药物的琼脂平板作为对照。在生物安全柜内，将已灭菌的接种针板安装到96点阵接种器的支架上。

接下来，将含有待测菌株的制备好的种子块和已接种的琼脂平板放置在移动载体上。推动移动载体，直至种子块位于接种针板下方。然后按下操作手柄，降低接种针板，使96根接种针对准种子块中96个孔内的接种物。

以受控方式释放操作手柄，自动复位接种针板，以搅拌每个接种液孔并浸入，将操作手柄下压两到三次。随后移动并定位载体板，使培养板位于接种针板下方。下压操作手柄，使接种针板下降，并保持一到两秒钟，以确保与培养板表面充分接触。

松开操作手柄，完成一轮接种。更换已培养的平板，重复此过程，直至完成整批抗菌琼脂平板的接种。更换新的接种针板和菌种块，以接种另一组待测菌株。

将接种后的抗菌琼脂平板在室温下孵育，直至接种液滴中的水分完全被琼脂吸收。孵育结束后，将平板倒置并继续孵育，使未受抑制的细菌形成菌落。为进行图像采集与数据统计，首先点击96点阵AST图像采集系统以启动程序。

从任务栏中选择测试信息。点击“新建”以创建新的测试任务，并填写所需信息。然后依次按下数据采集、拍照和测试项目，以选择新创建的任务。

选择抗生素以选定抗生素名称，选择梯度以设定抗生素的初始浓度。最后，单击连接以建立与图像采集转换器的连接。接下来，将孵育后的平板放置在检测平板底座上，并将其插入图像采集转换器中。

单击集合以拍摄平板图像。按下抗生素按钮并选择下一组平板。选择梯度以确定起始梯度，然后进行下一轮图像采集。

通过点击提交完成操作，以确定菌落形成情况并将图像转换为最低抑菌浓度，即 MIC 值。点击查询以获取所有 MIC 结果。首先采用双层琼脂法制备不同的噬菌体。

将噬菌体稀释至合适的平行浓度，然后将200微升噬菌体接种液加入96孔种子板中。接下来，为每种待检测的菌株制备一块双层培养平板。双层平板的盖子下方需留出空隙，以利于干燥。

将制备好的噬菌体种子块和双层平板放置在96点阵接种仪的移动载体上。将所有噬菌体接种物转移至半固体琼脂表面。让平板在室温下静置，直至所有接种物的液体完全被半固体琼脂吸收。

将平板在37摄氏度下孵育4至6小时，适用于所测试的菌株。使用图像采集转换器获取并保存每块双层平板实验结果的图像。根据所获得的图像，在电子表格中记录不同斑点形态的数量和形态特征，并计算各类噬菌体的相应比例。

在含氨苄西林的平板上对沙门氏菌生长进行的形态学研究表明，a-1 中的阴性对照无任何生长。沙门氏菌菌株在 a-4 中的最低抑菌浓度（MIC）为 64 微克/毫升，而 a-5 中为 16 微克/毫升。氨苄西林、环丙沙星和阿莫西林-克拉维酸的耐药率均高于 50%，而多西环素、氟苯尼考、头孢噻肟和恩诺沙星的耐药率在 30% 至 50% 之间。庆大霉素、阿米卡星和美罗培南的耐药率均低于 30%。环丙沙星和阿莫西林-克拉维酸的 LAR 指数差异显著。

在双层平板上对沙门氏菌生长进行的形态学分析表明，观察到噬菌体的四种主要斑点形态。圆形透明的裂解斑来自一种能够在平板上有效杀死宿主的噬菌体，但其可能成功也可能未能以宿主为代价进行复制。这些噬斑集合由真正的噬斑形成。

浑浊的裂解斑是由噬菌体在平板上未能稳定杀死宿主而形成的，该噬菌体可能无法成功利用宿主进行复制。无裂解斑表明其非裂解特性。该技术可快速高效地同时转移96个琼脂柱，仪器可自动识别图像并计算线性骰子值。

该技术有望推动噬菌体的研究及其产业化，而噬菌体的应用是减少和解决抗菌素耐药性（AMR）问题的令人瞩目的途径之一。