一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

该细胞微阵列平台的总体目标是，在不同微环境背景下，将细胞分化程度与牵引力的测量结果进行关联分析。该方法有助于回答组织工程领域中的关键问题，既可推动干细胞生物学的基础研究，也可用于优化细胞分化方案。该技术的主要优势包括高通量性、可调控生化与生物物理信号刺激，以及通过免疫荧光和牵引力显微镜（TFM）进行终点检测。

尽管已使用这些方法，但对于理解肝前体细胞分化而言，该方法可轻松应用于其他动脉细胞类型和组织环境。此方法的可视化演示至关重要，因为实验成功取决于阵列化方案与高质量水凝胶基底以及牵引力显微镜技术的整合。为了在硅化处理的35 mm玻璃底培养皿上制备含荧光微球的聚丙烯酰胺水凝胶，以通过TFM对细胞-基底相互作用进行活体评估，首先需按照文本方案中所述，在溶液中制备玻璃基底。

将硅烷化处理的35 mm玻璃底培养皿放入玻璃干燥盘中，用移液器将20微升9:1的预聚物微珠与光引发剂溶液滴加至每个培养皿的中央。轻轻盖上12 mm圆形盖玻片，避免产生气泡。为了使荧光微珠均匀分布于水凝胶表面，将培养皿倒置，在室温下静置20分钟。

倒置状态下，用 365 纳米的 UVA 照射培养皿 10 分钟。根据需要优化聚合时间。随后，将水凝胶浸入 1 摩尔 HEPES 缓冲液中，室温避光过夜孵育。

用刀片小心取下盖玻片，注意不要损坏已聚合的水凝胶。将水凝胶置于加热板上，在50摄氏度下脱水至干燥。水凝胶可在避光室温条件下保存三个月。

按照文本方案中的说明准备用于打印生物分子和源板的缓冲液。按照文本方案中的说明装载洁净的点样针后，准备微阵列仪并使用厂商提供的软件对其进行编程。然后，打开加湿器单元。

将设定点调整至65%相对湿度，并等待流变仪达到设定点。将源板放入相应的适配器中，然后将脱水的水凝胶基底放入相应的适配器中。

调整程序参数，以准确反映源板布局、阵列设计和所需格式。启动阵列制备。每小时至少检查一次湿度是否低于65%相对湿度，并检查针头是否堵塞。

如果湿度意外下降，请暂停点样，及时填充加湿器并清除相关管路中的冷凝水。如果针头堵塞，请暂停点样，清洗针头或更换为预先清洁好的针头。程序完成后，将制备好的微阵列放入载玻片盒或微孔板中，并用铝箔覆盖。

将芯片在室温、65%相对湿度条件下放置过夜。根据我们的经验，最常见的问题与芯片制备有关。我们建议使用荧光标记分子、通用蛋白质染色以及免疫荧光方法来确认所制备芯片的技术质量和稳定性。

制备后的第二天，将阵列置于含有3 mL青霉素-链霉素溶液（1%体积分数，溶于PVS）的35 mm培养皿中。将排列好的基底暴露于UVC下照射30分钟。随后将青霉素-链霉素溶液更换为细胞培养基。

收集并计数细胞后，将细胞以每35 mm培养皿3 mL的体积接种到阵列上。将细胞阵列培养物置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育2至24小时，或直至形成细胞密集的细胞岛。接种密度和孵育时间可根据细胞类型和具体应用进行调整。

在允许细胞岛建立后，用3 mL预热的细胞培养基将芯片培养物清洗两遍。此时，可向生物体系中加入相应的对照和感兴趣的处理因素。每隔一到两天更换芯片的培养基，以维持任何处理因素的浓度。

在启动阵列培养后的一至五天内，使用牵引力显微镜技术（TFM）对细胞与基质的相互作用进行活细胞评估。将含有阵列培养物的35 mm培养皿转移至配备机器人载物台的孵育式倒置荧光显微镜，用于TFM测量。在其中一个培养皿中，利用相差显微镜标记各个细胞岛的位置及其焦平面。

切换至远红荧光显微镜以观察微珠。然后返回上一步中保存的各个位置，并校正焦平面的 z 坐标，使位于细胞岛下方的第一层微珠恰好处于焦点。保存新的坐标，随后对所有细胞岛进行自动成像，以获取解离前的相差图像和远红荧光图像。

接下来，小心地向培养皿中加入 150 微升 BSA/SDS 溶液，静置 5 分钟，以使细胞完全从基质上解离。使用相差显微镜监测细胞解离情况。待细胞岛从基质上解离后，返回先前标记的位置，检查第一层微珠是否仍处于焦点位置。

如果由于细胞产生的牵引力导致变形，使得这些微珠不在焦平面上，则校正焦平面的 z 坐标，使其重新处于焦点中。保存校正后的 z 坐标，并重复对所有微岛进行自动成像，以获取解离后的远红荧光图像。对剩余的培养皿重复上述步骤。

与蛋白A/G偶联的Notch配体Jagged1和Delta-like1在水凝胶中表现出更优的滞留能力。Notch配体的呈递还驱动肝前体细胞向胆管细胞命运分化，这由绿色胆管细胞标记物的存在所指示。针对五种细胞外基质（ECM）蛋白对Notch配体的响应进行了定量分析，结果表明肝前体细胞对配体的响应依赖于ECM环境。

利用小发夹RNA敲低技术生成了不表达类delta样配体1和jagged 1的前体细胞。随后将这些细胞分别暴露于notch配体jagged 1、类delta样配体1和类delta样配体4。细胞对排列的notch配体的反应因细胞内源性表达上述任一配体的情况不同而有所差异。

这些图像显示了肝前体细胞的分化依赖于基质刚度和细胞外基质（ECM）成分。定量分析表明，IV型胶原在软基质和硬基质上均支持细胞分化，而纤连蛋白仅在硬基质上支持分化。代表性热图提示，在IV型胶原上，低基质刚度下持续的牵引力应力可促进向胆管细胞的分化。

这一结果通过牵引应力的平均均方根值的量化分析得到了证实。本视频及配套方案提供了制备水凝胶和阵列的主要步骤，用于在阵列化基底上进行细胞培养，并利用牵引力显微镜技术测量细胞与基底之间的相互作用。在熟练掌握相关技术后，若操作得当，每项实验可在一至两周内完成。

与该方法相对，应使用定性PCR、免疫印迹、标准尺度的机械生物学轴线或其他互补的分子生物学技术，通过细胞培养来验证得分较高的阵列条件。这一多功能平台可广泛应用于多种细胞和组织环境中细胞功能的高通量研究，包括干细胞分化和癌细胞生物学。