可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

本方案提供了一种细胞培养平台，可经济、便捷地精确控制细胞外基质的特性，如刚度、蛋白质组成以及细胞形态。该方法成本较低，无需特殊培训或设备，且与多种细胞定量方法兼容，例如免疫荧光染色和蛋白质印迹（western blot）。

该技术为施万细胞生物学提供了机制层面的理解。结合对神经系统再生相关生物材料设计的进一步认识，该方法可应用于任何依赖贴壁生长的细胞。本实验方案中最具挑战性的部分是微接触印刷技术。

在开始实验方案之前，使用荧光标记蛋白质在基底上进行微接触印刷，以直观验证最终印刷图案。首先用移液管尖剧烈混合PDMS基础弹性体与固化剂，直至气泡均匀分散在混合物中。然后通过真空干燥去除气泡。

在方形或圆形盖玻片上滴加一滴干燥的PDMS混合物，将盖玻片置于匀胶机上以2,500 rpm转速旋转30秒。将盖玻片置于60摄氏度的烘箱中孵育一至两小时，或在室温下过夜。为制备微图案化基底，将带有图案的硅片放入一个直径150毫米、高15毫米的圆形培养皿中，并将脱气后的PDMS倒入硅片上。

将PDMS在60摄氏度的烘箱中固化过夜。让PDMS冷却至室温。然后使用外科手术刀切割出30毫米×30毫米的方形印章，其中包含正确的图案，注意不要损坏硅片。

将PDMS印章和可调盖玻片浸入70%乙醇中30分钟以进行灭菌。为验证微图案的效果，使用过滤的气流吹干PDMS印章表面，并用移液器将15微克/毫升的BSA溶液滴加至印章的整个图案面。在室温下孵育印章与BSA溶液1小时，使蛋白质吸附，随后将印章置于空气中干燥，以去除BSA溶液。

使用过滤后的气流干燥可调盖玻片表面。将印章的图案面与可调盖玻片紧密贴合，使BSA在盖玻片表面吸附，并轻轻按压印章与盖玻片接触5分钟。使用配备FITC滤光片的荧光显微镜观察微图案。

为了打印细胞黏附区域而非荧光图案，需用层粘连蛋白（laminin）替代BSA蛋白。将印章从盖玻片上取下，然后将盖玻片转移至已灭菌的六孔板中。每孔加入2毫升0.2% Pluronic F-127溶液，确保溶液覆盖盖玻片表面，并在室温下孵育1小时。

吸弃F-127溶液，用PBS洗涤盖玻片5次，再用细胞培养基洗涤1次，随后以每平方厘米1000个细胞的接种密度接种施万细胞。细胞接种45分钟后，移除培养基并用PBS洗涤盖玻片2次，以防止多个细胞黏附于同一图案。将细胞在所需的培养环境中维持48小时后进行定量分析。

为了制备用于观察排列细胞的线性图案化细胞培养基底，按照文稿中的说明制备印章，并将其切割至所需尺寸。准备两个如前所述涂有可调谐PDMS表面的培养皿，对其中一个培养皿进行微接触印刷，以印制出具有线性图案的细胞黏附区域。移除印章后，向培养皿中加入4毫升0.2% Pluronic F-127溶液，孵育1小时。

用70%乙醇将PDMS印章每面冲洗三次，并用空气吹干。旋转PDMS印章，按照先前所述方法，将未图案化的细胞黏附区域打印到第二个培养皿上。在培养皿中加入F-127溶液孵育后，移除溶液，并用PBS洗涤三次，再用新鲜细胞培养基洗涤一次。

然后将细胞接种到培养皿中，并在制备裂解液前于所需条件下培养48小时。制备裂解液时，先用预冷的PBS洗涤细胞2分钟，然后按照文稿说明配制RIPA溶液，每块细胞贴壁区域加入80 µL，并将细胞置于冰上孵育25分钟。用细胞刮板刮取许旺细胞5分钟，收集裂解液至预先标记的1.5 mL微量离心管中。

在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心裂解液 15 分钟。收集上清液并转移至洁净的微量离心管中。与胶原蛋白和纤连蛋白包被的基质相比，层粘连蛋白包被的基质可实现更高的增殖速率。

在具有层粘连蛋白涂层且模量不同的基质上培养的施万细胞显示，相对较软的基质会降低细胞增殖速率。同时还分析了细胞的蛋白质表达情况。随着基质变软，转录因子c-Jun的表达上调。

然而，在最柔软的基质上，其表达显著下调。在较硬的基质上，胶原包被的基质导致c-Jun表达最高；随着基质变软，层粘连蛋白则表现出最高的c-Jun水平。随后，细胞经鬼笔环肽-罗丹明染色，以探究细胞铺展和面积在c-Jun表达中的作用。

当在细胞培养基底上构建细胞黏附线条时，接种于图案化基底上的细胞其核长宽比相较于无图案基底上的细胞有所增加。在铺展面积较小的密集细胞中，c-Jun 和 p75 神经营养因子受体的表达均上调。与无图案细胞相比，线条图案化细胞中 c-Jun 和 p75 NTR 的表达水平也更高。

通过微接触印刷技术构建细胞黏附几何图案，以精确控制细胞铺展面积和伸长程度，同时消除细胞间的相互作用。随着细胞长宽比的增加，细胞核的伸长程度也随之增加。c-Jun的表达水平因细胞伸长和细胞铺展受限而上调。

针对细胞核和肌动蛋白的免疫荧光染色证实，通过该微图形化方法可精确控制细胞铺展面积和伸长程度。该技术为利用可调基底作为研究施万细胞生物学及其在再生和癌症背景下信号转导机制的分析方法奠定了基础。