一种用于表征调控线虫时序性寿命遗传关联的抑制子筛选方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

衰老的特征是多种细胞过程随着时间推移而逐渐恶化，最终增加生物体死亡的概率。在群体中，这一过程存在差异，多种遗传和环境因素均可影响衰老进程。其中研究最为深入且理解较为透彻的变量之一，是饮食对寿命的影响。

饮食限制是一种能够延缓衰老及与衰老相关变化发生的干预手段。这种干预可延长生物体的寿命和健康寿命，即生物体保持正常、健康状态的时间长度。目前的研究已确定了一系列特定的细胞变化，这些变化被称为衰老的标志，包括突变的累积、端粒调节失调、蛋白质稳态的丧失、呼吸功能障碍以及活性氧物质的增加等。

目前，这些认识的获得主要依赖于使用多种不同模式生物开展的研究。已有大量遗传筛选实验鉴定出了一系列既能缩短也能延长寿命的基因。这些研究包括对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的研究，这也是本方法的重点，同时还包括对更复杂的多细胞生物（如秀丽隐杆线虫 C.elegans 和小鼠系统）的研究。

在这些模式生物中，芽殖酵母尤其适合用于衰老研究，因其自然寿命较短，并具备多种遗传学研究手段，可揭示复杂的遗传关系，是解析衰老遗传机制的理想体系。酵母可用于研究衰老的多个不同方面。本文将重点关注时序性寿命，即细胞能够存活的时间长度。

本研究的目的是展示一种直接的遗传学方法，用于进行过表达抑制子筛选。我们将利用一种导致异常缩短的时序性寿命的遗传背景，并采用靶向策略来鉴定能够挽救或抑制这种寿命缩短表型的基因，以期发现能够恢复正常寿命的基因。

第一种遗传背景是自噬缺陷型酵母菌株。自噬（字面意义为“自我吞噬”）是一种细胞内降解系统，可将细胞质中的产物（如蛋白质和细胞器）运送至溶酶体。该过程通过清除受损蛋白以及寿命已尽的蛋白，有助于维持细胞稳态。

我们将使用一种ATG1基因缺失的突变菌株。ATG1编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白在细胞质到液泡靶向途径中囊泡形成和自噬过程所必需。ATG1缺失突变体表现出异常缩短的时序性寿命表型。

在本衰老研究实验中，我们将设计并检测能够挽救或抑制 ATG1 基因缺失突变体异常缩短寿命表型的遗传因子。然而，该方法也可拓展至其他短寿命遗传背景的研究。该过程的第一步是鉴定与延长寿命相关的基因。

我们将重点关注那些在过表达时能够延长时序寿命的基因。为此，我们将使用从酵母基因组数据库中可公开获取的数据。我们现在就到这里操作。

按表型进行搜索。向下滚动至页面中段，我们可以选择“时序寿命”。为了寻找能够延长寿命的基因，您可以看到，已有大量数据将特定基因与该表型相关联。

今天，我们将研究SIR2，这是一种组蛋白赖氨酸去乙酰化酶，当其过表达时，与延长的时序性寿命相关。首先，我们将获取该基因编码区的DNA序列，以及位于其两侧的调控区域序列。为了确保涵盖所有调控区域，我们将在基因上下游各取400个碱基对。

我们将利用该DNA序列设计PCR引物，以便将此基因克隆至质粒载体中。我们将使用PCR扩增该基因，并将其克隆到pRS315载体中。为此，我们将设计包含限制性酶切位点的引物，引入HindIII和SacII限制性酶切位点。

如您所见，该质粒包含两个限制性酶切位点，即 HindIII 和 SacII，这将有助于我们的克隆操作。您应设计 PCR 引物，使其包含约 21 或 22 个核苷酸的序列，该序列与您希望扩增的区域互补。除了这段序列外，还需在引物的 5' 端分别添加相应的限制性酶切位点：在正向引物上添加 HindIII（此处以红色表示），在反向引物上添加 SacII（此处以紫色表示）；并且在这类酶切位点的上游再添加数个核苷酸，以利于限制性内切酶高效结合并形成有效的酶切位点。

在富含营养的培养基（如 YPAD）中，将 5 毫升野生型酵母培养物于过夜培养至对数后期。使用专用于真菌基因组分离的市售试剂盒提取基因组 DNA。必须选用专为酵母设计的试剂盒，因为酵母具有极为坚韧的细胞壁，难以破除。

使用Zymolyase处理可有效降解细胞壁，并显著提高基因组DNA的得率。使用分光光度计测定DNA的浓度和质量。为了获得适合克隆的扩增片段，必须使用高保真PCR聚合酶，以避免在扩增过程中引入突变。

市面上有多种不同的高保真 PCR 试剂盒可供选择。为了便于反应条件的优化，我们建议选择提供多种缓冲体系的试剂盒，其中一种为标准高保真缓冲液，另一种则针对复杂扩增片段中高 GC 含量的模板进行了优化。我们将加入 200 纳克的基因组 DNA。

我们将加入5 µL的缓冲液。我们将加入2.5 µL的正向引物和反向引物。我们将加入1 µL的聚合酶，2 µL的dNTPs。

最后，我们将使用无菌蒸馏水将整个反应体系定容至 50 µL。根据本实验所用酶的特异性以及我们设计的引物，按照相应的实验方案进行反应。随后对 PCR 反应产物进行纯化和浓缩。

在选择性培养基中过夜培养5 mL的大肠杆菌（E.coli）菌液。通过离心收集菌体沉淀，并弃去上清液。用提供的变性缓冲液重悬菌体，室温裂解5分钟。

中和反应，通过倒置混合五到六次。以最大速度离心样品10分钟。将上清液转移至硅胶柱中，并用提供的缓冲液洗涤。

弃去穿流液，用其他适当的缓冲液重复洗涤步骤，每次间隔30秒离心，每次均弃去穿流液。最后再离心2分钟，以去除残留的乙醇，将质粒洗脱至20 µL洗脱缓冲液中，并用分光光度计测定其浓度和质量。接下来，开始进行载体和插入片段的限制性酶切反应。

加入625纳克DNA（载体或插入片段）、5微升CutSmart缓冲液、1微升SacII、1微升HindIII，并用水补足至终体积为50微升。将限制性消化反应在37摄氏度孵育3小时，随后在80摄氏度加热20分钟以灭活酶。此时，消化产物可在进行下一步前于4摄氏度保存。

接下来，我们将使用已消化的基因组片段以及刚刚制备好的载体，进行15微升连接反应体系的搭建。首先加入6微升水，然后加入2微升已消化的载体。

这是我们的 pRS315 质粒。我们将加入四微升的插入片段，即 SIR2 基因。我们将加入两微升的连接酶缓冲液，即 10X 缓冲液。

最后，我们将加入一微升连接酶。在16摄氏度下孵育过夜，然后在80摄氏度下加热20分钟以灭活酶。为了筛选成功构建的质粒，我们将质粒转化至大肠杆菌（E.coli）中。

我们将使用 50 µL 的化学感受态细胞。将其在冰上融化，一旦融化立即加入连接反应产物，并加入其全部内容物。因此，我们将含插入片段的 15 µL 连接产物加入其中，同时将 15 µL 无插入片段的对照也加入到另一个独立的反应体系中。

加入后，轻轻弹击管壁数次以混匀。随后将样品置于冰上孵育。在冰上孵育30分钟后，将样品转移至42°C的加热模块中，进行20秒的热激孵育。此时取出样品，加入复苏培养基。

热激处理后，我们将进行一段恢复期。取样品后加入 450 µL SOC 培养基，在 37 °C 下孵育，以使质粒被细胞吸收，并启动氨苄青霉素抗性基因的表达。

我们将让这些样品在37摄氏度下恢复45分钟。孵育结束后，我们进行一系列稀释，分别为10倍和100倍稀释，并将样品涂布于LB/Amp培养基上，过夜培养使细胞生长。我们将采用无菌操作技术进行涂布。

我们将取用已正确标记并含有筛选标记的平板。取150微升转化后的E.coli，用无菌接种环将菌液均匀涂布于平板表面，确保菌液在整个平板表面分布均匀。

完成所有稀释液的涂布后，我们将这些平板在37摄氏度下过夜培养，以观察菌落生长情况。大约一天后，我们应该能看到菌落生长，这些菌落有望含有我们试图构建的质粒。它们看起来应该类似于这样。

采用无菌操作技术，按照先前所述步骤，将转化后生长的潜在转化子接种至5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中。从每个潜在转化子中提取质粒，并按先前所述方法进行限制性酶切消化。将酶切反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，将潜在转化子与空载体进行比较。

保存所有导致正确大小插入片段被切除的转化子，以供进一步研究。在成功构建质粒后，我们将把该质粒转化至ATG1基因缺失的酵母背景菌株中。我们将取15 mL细胞并离心收集菌体，这一操作我已在此处完成。

离心沉淀后，移除细胞原本生长的 YPAD 培养基，并用蒸馏水洗涤细胞。随后，将细胞重悬于 100 毫摩尔的醋酸锂溶液中，重悬体积为 200 微升。

通过轻轻吹打重悬细胞沉淀。将细胞分装到不同的微量离心管中，每管用于一次转化，每次转化使用50 µL该混合液。每管转化反应中需加入240 µL的50% PEG。

PEG 黏性很高，移液和测量时需格外小心。每次加入 PEG 以及每种其他组分后，均需通过移液充分混匀。接下来，为每项转化反应依次加入 36 微升 1 摩尔的醋酸锂、5 微升经煮沸 5 分钟后置于冰上的鲑鱼精子 DNA 或其他载体 DNA，最后加入 5 微升质粒 DNA。

充分涡旋混匀各管。将样品在30°C下孵育45分钟，随后在42°C下热激10分钟，然后用无菌水洗涤细胞一次，最后重悬于200 µL无菌水中。

将每种转化后的酵母菌株分别进行1:10和1:100稀释，并将150微升菌液涂布于SC缺亮氨酸平板上，用于筛选质粒。均匀、平整地涂布菌液，待平板表面干燥后倒置，于30摄氏度培养48至72小时。在成功克隆待测基因后，我们将检测其对生物体时序性寿命的影响。

我们将培养酵母，并监测随时间变化的存活菌落形成单位数量。首先在30摄氏度下，于SC缺亮氨酸液体培养基中振荡培养酵母72小时。使用血细胞计数板确定所需的稀释倍数，以便能够接种500个细胞。

采用无菌操作技术，将细胞接种至缺乏亮氨酸的SC平板上，待其干燥后，于30摄氏度倒置培养三天，直至菌落生长可见，此时可观察菌落生长情况并记录该时间点的数据。制备平板后，继续将酵母在30摄氏度下静置培养。最初，我们以每周为间隔重复进行接种，若初步数据显示衰老表型受到抑制，则增加取样频率，采集更密集的时间点数据。

为了确定存活率百分比，我们将各时间点的数据归一化至第一天进行分析。务必在每个时间间隔接种相同的稀释度。持续进行此过程，直至不再观察到菌落生长为止。

将您的信息输入 Excel 电子表格会很有帮助。这样可以在实验结束时快速确定每种菌株的存活率。