使用 S. cerevisiae 时序寿命模型研究年龄依赖性基因组不稳定性

本实验的总体目标是通过将酵母的时序性寿命测定与一系列简单的DNA损伤和突变检测方法相结合，研究年龄依赖性的基因组不稳定性。首先，每两天取样一次时序性衰老培养物，并通过菌落形成单位（CFU）测定细胞活力。接下来，取衰老培养物样品，将细胞涂布于特定突变筛选培养基上，以检测DNA突变情况。

最终，可通过将突变检测结果归一化至细胞活力，获得酵母时序性衰老过程中DNA突变变化的结果。该方法有助于回答衰老研究领域中的关键问题，例如衰老与基因组不稳定性之间关联的机制。为检测酵母时序性寿命（CLS），首先将单个酵母菌落接种至1毫升合成完全葡萄糖（SDC）培养基中，在30摄氏度下振荡培养过夜。次日，将过夜培养物按OD600为0.05至0.1的比例稀释至10毫升新鲜SDC培养基中，在30摄氏度下振荡培养三天。

第三天，当细胞处于稳定期时，用去离子水将每种Eloqua稀释10,000倍，然后从锥形瓶中取出两个10微升等分试样，将每个稀释培养物的10微升分别涂布于A-Y-E-P-D平板上。将平板在30摄氏度下培养，直至菌落出现。第三天培养物所形成的菌落数量或菌落形成单位被视为100%存活率。

在后续几天内继续从老化培养物中取样进行涂布。相应调整稀释倍数，以确保菌落形成单位（CFU）测定中约有20至100个菌落。当培养物的存活率降至1%以下时停止取样，通常在第11至13天之间；也可在平板上老化培养的细胞中研究细胞存活率。

开始该实验时，挑取单菌落接种于1毫升合成完全葡萄糖培养基中，在30摄氏度下振荡培养过夜。当菌液浓度达到约每毫升10的8次方个细胞时，用高压灭菌水将菌液稀释至每10微升含100至200个细胞，以及每10微升含1000个细胞。针对每种菌株，准备8至20块色氨酸缺陷型SDC平板，并根据涂布密度做好标记。

为确保在预期衰老过程中细胞活力下降的情况下仍能计数到10至100个菌落，每个培养皿上接种两份稀释后的培养物，每份体积为10至30微升。在接种当天将培养皿置于30°C条件下培养，并在整个寿命分析期间每两天取出一个培养皿，逐滴加入0.5毫升色氨酸溶液，使有活力的细胞得以生长。随后将该培养皿在30°C下继续培养48至72小时。

48 至 72 小时后，对色氨酸添加当天的细胞进行菌落形成单位（CFU）计数，以检测在时间性衰老过程中 DNA 损伤和突变频率。在酵母复制性寿命（CLS）测定中，若干具有特殊特征的菌株与野生型菌株平行培养。

可通过测量时间衰老培养物中刀豆素抗性频率来评估自发突变频率。编码血浆精氨酸透性酶的can1基因发生突变会使细胞对精氨酸类似物L-刀豆素产生抗性，因而具有刀豆素抗性的细胞可在添加了L-刀豆素硫酸盐的精氨酸缺失合成完全培养基平板上生长。通过检测携带trp1基因琥珀突变菌株中色氨酸阳性回复突变的频率，结合测序分析，可估算酵母时间衰老过程中碱基替换的速率。

在色氨酸缺陷型培养基平板上，正向回复突变细胞能够生长。裂解阴性菌株EH150在开放阅读框中携带一个+4碱基移码突变，导致其无法合成赖氨酸，因而表现为赖氨酸营养缺陷型；该表型可通过小片段插入或缺失突变而发生回复。回复突变子将在赖氨酸缺陷型培养基平板上进行筛选，以检测大规模染色体重排（GCR）事件。

使用一种突变菌株，其中位于五号染色体上 can1 基因端粒端 7.5 千碱基处的 HXT13 基因被 URA3 插入片段破坏。can1 和 URA3 基因的突变分别使细胞对 L-Canavanine 和 5-氟乳清酸产生抗性。由于这两个基因同时发生点突变的频率较低，因此通过分析对 L-Canavanine 和 5-氟乳清酸双重抗性的频率，可估算基因组不稳定性（GCR）水平，以监测同源和非同源重组的发生程度。在时序性衰老过程中，会产生携带 100% 同源反向重复序列或 91% 同源反向重复序列的突变体。

IRS 在 his 三位点的重组使得 IRS 能够表达有功能的 his 三位点蛋白。因此，发生重组的细胞将在添加了半乳糖的缺乏组氨酸的培养板上生长。在第三天，当细胞处于静止期时，将从每种衰老培养物中取出适量的细胞。

由于所有检测均采用相同的步骤，因此仅处理一个样本。本视频中，通过台式离心机离心使细胞沉淀。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升经高压灭菌的水中。

再次移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 µL 水中，将细胞涂布于相应的平板上，以筛选所需回复突变子。将平板在 30 °C 下培养，3 至 4 天后计数 CFU，突变频率将根据存活细胞数量进行标准化。该图展示了典型的时间顺序寿命测定实验中的代表性结果，其中野生型细胞的时间顺序存活率与 S. cerevisiae Δtor1 Δras2 突变体进行了比较。

在缺乏 TOR1、SCH9 或 RAS2 的液体培养突变体中，其复制性寿命延长。此外，SCH9 和 RAS2 的缺陷在不同碳源存在条件下对延长寿命和复制存活具有累加效应。下一张图展示了采用 NC2 活性检测法的结果。

第一天，将SDC野生型培养物稀释后接种于无碳源的SC三缺培养板上。补充有葡萄糖、乙醇或甘油的SC三缺培养板在30摄氏度下培养，每两天取出一套培养板，加入适当的营养物质以促进生长和菌落形成。

突变频率随年龄的变化很大程度上取决于菌株、背景、遗传操作、培养方式、条件以及年龄。本表格展示了在野生型菌株中获得的典型结果。下一图像展示了跨损伤合成的代表性结果。

与年龄相关的突变频率增加可能涉及使用细胞核提取物和不同DNA模板时错误的DNA修复机制的变化。我们可以评估在时间老化细胞中的跨损伤合成（TLS）。分析了来自培养三天的静止期、野生型以及SCH9Δ突变细胞的细胞核提取物。

使用未受损模板的TLS产物以实线表示，使用受损模板的TLS产物以虚线表示。在长寿的s CH九号delta突变体的细胞核提取物中未观察到跨损伤合成，游离引物以空心箭头表示。观看本视频后，您应充分掌握如何在酵母中进行时序性寿命测定和DNA突变分析。