重建线粒体膜动力学的模型膜平台

在本研究中，我们介绍了一种模拟线粒体内部膜脂质环境的体外重建平台。该平台可用于研究线粒体内部膜融合的分子机制。该技术的主要优势在于，可在接近天然的环境中对整合膜蛋白和膜相关蛋白进行定量研究。

首先，根据手稿说明将溶液 A 和 B 混合，然后使用玻璃注射器将计算好的储存液体积加入棕色小瓶中以制备脂质混合物。通过向小瓶中添加额外的氯仿来调节至最终体积。将显微镜盖玻片在 520 摄氏度下烘烤 30 分钟。

烘烤后，将其冷却至室温。在搅拌的同时，将约10克氢氧化钠加入500毫升甲醇中。搅拌两小时，并持续向溶液中加入氢氧化钠，直至出现沉淀。

依次使用10%十二烷基硫酸钠溶液、饱和氢氧化钠的甲醇溶液以及50毫摩尔盐酸溶液清洗载玻片，每种条件下均超声处理30分钟。每次处理之间，用超纯水清洗载玻片10分钟。将清洗后的盖玻片密封保存在盐酸溶液中，最多可保存两周，以确保良好的双层膜质量。

使用氯仿和超纯水清洁Langmuir-Blodgett提拉系统的聚四氟乙烯槽，直至观察不到润湿现象。将氯仿喷洒在槽表面，用纤维素擦拭纸彻底擦拭三次，然后用超纯水冲洗三次，并通过抽吸去除水分。操作完成后，用洁净的超纯水覆盖槽表面。

从清洗液中取出两片经过表面处理的盖玻片，用超纯水冲洗约30秒。使用基底夹具将盖玻片背对背放置以固定玻片。在Langmuir控制系统上手动点击“dipper down”，将玻片浸入水面以下。

将膜天平归零，并在气-水界面处逐滴小心地铺展溶液B。确保脂质仅在气-水界面铺展，避免氯仿和脂质液滴沉降至聚四氟乙烯表面底部，否则会形成脂质通道，阻碍单层膜的形成。当膜天平读数达到约15至20毫牛顿每米时，停止添加脂质。

等待10至15分钟，然后启动屏障控制器，通过点击“开始实验”来改变表面积。等待膜天平读数上升至37毫牛顿每米，并将压力维持约20至30分钟。以每分钟22毫米的速度提升盖玻片，同时保持表面张力为37毫牛顿每米。

通过Blodgett浸渍法，将带有聚合物锚定的脂质单层从气-水界面转移到盖玻片表面，形成脂质双层的下层脂质单层。用抽吸法清洁气-水界面，并用超纯水冲洗槽体。用氯仿、乙醇和超纯水清洗单孔玻片后，将其置于水层下方的槽体中。

确保小孔朝上对准空气-水界面，倒入新鲜的超纯水直至完全覆盖载玻片，然后按照之前所述方法将载玻片浸入水面以下。使用硅胶吸盘夹住带有脂单层的盖玻片，轻轻将脂单层推至空气-水界面。在界面处将盖玻片保持2到3秒，然后将其压向载玻片。

取出带有盖玻片的载玻片。将盖玻片及其上的双层脂膜置于倒置荧光显微镜下，根据正文手稿中的说明对脂双层进行成像。准备一个含有超纯水的结晶皿，并在皿下方放置一个干净的显微镜成像用环。

将含有脂质双层的载玻片和盖玻片浸入水面以下。从底部握住盖玻片，轻轻分离载玻片和盖玻片，并将盖玻片转移至成像环中。用 Bis-Tris 氯化钠缓冲液替换成像环中的超纯水，注意确保脂质双层不接触任何气泡。

向脂质双层中加入1.1 纳摩尔的正辛基-β-葡萄糖吡喃糖苷，然后立即向成像环中加入1.2 纳摩尔 DDM 与1.3 皮摩尔纯化的 L-OPA1 的混合物。将样品置于台式摇床中，低速振荡孵育两小时。将30 毫克 SM-2 树脂珠加入3 毫升 Bis-Tris 缓冲液中并振荡。

使用塑料移液管向成像环中加入 5 至 10 微升 SM-2 树脂珠，孵育 10 分钟，然后冲洗树脂珠。成像环中缓冲液的最终体积应为 1.5 毫升。在氯仿溶液中配制一毫克脂质混合物 A，然后在氮气流下蒸发氯仿 20 分钟。

将混合物在真空条件下放置过夜，以形成脂质膜。通过将15.56克钙黄绿素溶解于50毫升1.5摩尔/升氢氧化钠溶液中，制备含钙的50毫摩尔/升缓冲液。在室温下搅拌混合物，直至钙黄绿素完全溶解。

加入12.5毫摩尔的双-Tris和超纯水，定容至500毫升，并将pH值调节至7.5。将脂质膜分散于含钙黄绿素的缓冲液中，然后在65摄氏度加热悬浮液20分钟，使脂质充分水合。通过聚碳酸酯膜挤出形成200纳米的脂质体。

加入2微克L-OPA1至0.5微摩尔DDM中，再加入2.2毫克脂质体，于4摄氏度孵育1.5小时。使用3.5千道尔顿透析盒，在4摄氏度下用250毫升含25毫摩尔bis-tris、150毫摩尔氯化钠和50毫摩尔钙缓冲液透析过夜以去除表面活性剂，期间更换缓冲液两次。使用PD10脱盐柱去除多余的钙黄绿素，随后按照文稿中所述进行成像和数据分析。

此处展示了脂质双层及其脂质流动性的落射荧光显微镜图像。显示了光漂白前后脂质的分布情况，以及重组前后脂质双层的均一性。通过荧光相关光谱（FCS）验证了L-OPA1重组的脂质双层。

FCS 曲线表明，75% 的 L-OPA1 被重组到脂质双层中，提示 L-OPA1 可在聚合物锚定的脂质双层中自由扩散，并具有自组装成功能复合物的潜力。荧光阶梯漂白实验显示，在特定脂质体中平均重组了两到三个拷贝的 L-OPA1。在重组后，采用动态光散射（DLS）检测 L-OPA1 重组蛋白脂质体的粒径分布，并通过 FCS 验证。

通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察脂质双分子层表面Texas Red的信号来监测膜拴系。通过脂质体标记物Texas Red扩散至脂质双分子层，监测膜脂质去混相或半融合现象。钙黄绿素去猝灭有助于区分完全融合孔的形成与仅发生脂质去混相的情况，从而能够比较颗粒停滞于半融合状态与进一步进展至完全融合状态之间的差异。

膜拴系表现为脂质体的稳定脂质信号，且钙黄绿素信号无去猝灭现象，而德克萨斯红信号的快速衰减表明染料扩散进入脂双层。完全融合则同时表现为脂质信号衰减和内容物释放。在进行此实验时，请务必彻底清洁盖玻片和朗缪尔槽，以确保制备出高质量的脂双层。

良好的空气质量对于防止双层膜缺陷也至关重要。该技术为我们探索线粒体膜动力学与组织方面的新问题铺平了道路。令人期待的未来实验包括探究双层膜不对称性、膜电位以及与疾病相关的突变体对线粒体内膜动力学的影响。