利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构
2023年6月30日
本方案介绍了一种用于培养SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化与染色的工作流程，旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜对线粒体超微结构进行可视化与分析。
我们的研究项目聚焦于线粒体的结构与功能，特别是与衰老相关功能障碍有关的方面。为此，我们采用多种生物物理、生物化学和结构生物学技术，探索线粒体衰老的基本机制，并开发用于维持和恢复线粒体健康的治疗干预手段。线粒体的功能与结构密切相关。
标准的光学显微技术适用于测量线粒体的大尺度特征，例如基本形态和网络结构。对于需要高于传统光学显微镜分辨率的线粒体超微结构或特征的分析，通常采用电子显微镜或断层扫描技术对固定样品进行观察。超分辨率显微技术是一种基于荧光的成像方法，能够检测超出衍射极限的结构特征。
对于线粒体，这包括纳米级蛋白质分布和嵴结构的测量。此处描述的STED成像方案使研究人员能够在活细胞中测量内膜的精细结构。活细胞STED成像使我们能够在生理相关条件下观察并定量分析嵴的复杂特征，而无需对样品进行固定。
这将使研究人员深入了解超微结构特征的动态变化及其对压力因素和药物化合物的时间响应。首先，在补充有10% DMSO的FBS中快速解冻SH-SY5Y细胞的冷冻保存液，并用预热的培养基稀释十倍。然后离心细胞并弃去上清液。
将细胞沉淀重悬于5毫升预热的培养基中，并将细胞接种至T25培养瓶。为制备多聚赖氨酸（PDL）包被的盖玻片，向无菌腔室盖玻片的每个孔中加入600微升浓度为50微克/毫升的PDL溶液。根据孔的大小，每个孔中加入的PDL溶液体积可能有所不同。
将盖玻片在室温下孵育一小时。孵育结束后，除去多聚赖氨酸（PDL）溶液，并用1.8毫升蒸馏水冲洗盖玻片三次。让包被好的培养腔室在空气中干燥两小时。
当 SH-SY5Y 细胞融合度达到 80% 至 90% 时，加入胰蛋白酶溶液进行消化。加入预热的 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶。离心细胞悬液，并将沉淀重悬于 DMEM 中。
使用自动细胞计数器对细胞进行计数。随后，将细胞以每平方厘米1.5 × 10⁴个细胞的密度接种至PDL包被的腔室载玻片中。在第1天和第3天，更换培养基为DMEM，分别添加5%或2% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂，并分别加入10 µmol RA或等体积的95%乙醇，后者作为分化的溶剂对照。
根据细胞分化状态，用预热的不含酚红的DMEM培养基配制PKMO储存液，培养基中添加2%或10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素-抗真菌剂以及20毫摩尔HEPES。在第6天，用成像培养基冲洗细胞两次，然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞与PKMO溶液共同孵育30分钟。染色后，用预热的成像培养基冲洗细胞三次。
最后一次洗涤时，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，用含有20毫摩尔HEPES的新鲜预热成像培养基替换最后一次洗涤液。打开Lightbox软件以进行图像采集。
选择激光和滤光片组合时，从染料列表中选择染色所用的染料，以设置橙色染料的参数。通过概览图像，单击 LIVE 以聚焦细胞。待细胞清晰聚焦后，调整共聚焦采集参数。
接下来，选择矩形 ROI 按钮，通过单击并拖动来围绕目标线粒体创建感兴趣区域。为了调整受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）成像的探测器门控，请在 GENERAL 菜单旁选择 GATING 菜单，或单击并按住以将该菜单添加到视图中。对于 STED 成像，将激发激光设置为 15% 至 20%，将 STED 耗尽激光设置为 20% 至 25%，并设置 10 次线累积。
采用4微秒的像素驻留时间，像素大小为20至25纳米。通过选择“时间”下拉菜单，设置迭代次数为5次，时间间隔为25或30秒，以进行延时成像。可使用“体积”选项并调节所需的Z轴体积范围和步长，来获取Z轴层扫图像。
打开STED图像去卷积软件，使用软件算法对原始STED图像进行去卷积。在确认显微镜参数正确后，选择“快速”按钮，并将去卷积类型设置为“快速”、“标准”、“激进”或“保守”，以实现不同程度的去卷积强度。执行去卷积操作。
将图像保存为 ICS2 格式。在 ImageJ 中，单击“文件”，然后选择“打开”，以从去卷积软件中打开 ics2 文件。选择“插件”，然后选择“分割”，接着选择“可训练的 Weka 分割”插件来打开去卷积后的 STED 图像。在分割设置中，选择高斯模糊、膜投影和 Sobel 滤波器特征。
将一个类别标记为“嵴”，另一个类别标记为“背景”。接着，在结构上绘制一条线，以分配至任一类。然后在右侧选择“嵴”或“背景”对应的“添加”按钮。
然后在左侧选择“训练分类器”按钮，根据提供给插件的信息生成图像。单击“保存分类器”按钮，以保存分类器设置，供后续分割使用。在 ImageJ 中利用嵴概率图对图像进行阈值分割，生成二值化掩膜，然后进入“分析”菜单，选择“分析颗粒”。
最后，绘制一条多点连线，将线条粗细调整为几个像素宽，并对线条进行样条拟合以贴合线粒体轮廓。本研究展示了对未分化的、经视黄酸分化的SH-SY5Y细胞进行线粒体成像，并采用延时成像技术。去卷积后的STED图像可用于测定特定区域内嵴的周期性以及嵴的大小和形态参数。
概述
本研究介绍了一种用于SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化及染色的实验方案。旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜观察和分析线粒体的超微结构，从而揭示活细胞中线粒体的结构动态特征。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 线粒体研究
背景
- 线粒体的结构和功能对细胞健康至关重要。
- 传统显微镜在超微结构分析中的分辨率有限。
- 超分辨率显微镜可实现对线粒体特征的更精细成像。
- 了解线粒体的变化有助于揭示衰老和功能障碍的机制。
研究目的
- 建立一种可靠的方法，用于在活细胞中研究线粒体超微结构。
- 使研究人员能够分析线粒体形态的动态变化。
- 为研究线粒体对各种处理的响应提供基础。
使用的方法
- SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞的培养与分化。
- 原代大鼠海马神经元的制备。
- 使用受激辐射损耗显微镜（STED 显微镜）进行高分辨率成像。
- 关键步骤包括细胞复苏、盖玻片包被以及 PKMO 染色。
- 通过特定软件及插件进行图像采集与分析。
主要结果
- 成功实现线粒体结构在纳米级分辨率下的可视化。
- 揭示线粒体内嵴的结构特征及蛋白质分布情况。
- 对生理条件下线粒体特征变化进行定量分析。
- 关于线粒体对药理学化合物反应的潜在重要发现。
结论
- 该研究展示了一种用于探究活细胞中线粒体动态的有价值技术。
- 有助于理解线粒体在细胞衰老与健康中的作用。
- 对旨在恢复线粒体功能的治疗干预具有重要意义。
常见问题
行业应用价值
在神经元模型中，对线粒体内膜超微结构进行活细胞STED成像，能够在生理相关条件下直接、定量地可视化观察嵴的结构以及纳米尺度的蛋白质分布。该技术填补了线粒体结构与功能及疾病机制之间关联研究的关键空白，有助于提升在早期神经退行性病变研究和靶点验证中的预测可信度。将超分辨率成像整合到发现工作流程中，可增强机制层面的风险评估，并为神经治疗项目的风险调整型组合决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在活体神经元系统中直接验证线粒体结构假说。
- 通过量化嵴的形态与动态变化，支持功能靶点的验证。
- 有助于在神经退行性疾病模型中揭示线粒体功能障碍的机制，降低研发风险。
- 提供高分辨率证据，以支持对早期阶段靶点的预测可信度评估与优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的活细胞成像检测方法，用于线粒体超微结构的定量分析。
- 提供可重复的定量结果，用于测量嵴的周期性、大小和形态。
- 支持检测方法的标准化及平台化，适用于影响线粒体形态的化合物筛选。
- 支持对药物效应在线粒体内膜特征上的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将线粒体结构的读数与疾病相关的神经元模型相对应。
- 实现从发现阶段的成像到线粒体靶向干预的临床前验证之间的连续性。
- 基于动态、定量的超微结构数据，支持经风险调整的推进决策。
- 支持神经退行性疾病中线粒体健康转化生物标志物的开发。
流程与工作流整合
该活细胞STED成像方案可融入从发现到临床前研究的连续流程，架起早期机制研究与神经疾病模型中转化研究之间的桥梁。
- 发现生物学： 对嵴结构的定量成像支持在线粒体研究中进行假设检验和生物学风险评估。
- 筛选： 高分辨率、可重复的输出结果可为靶向线粒体结构的化合物评价提供即用型检测支持。
- 分析： 提供对嵴的周期性、大小和形态的定量测量，实现不同条件间的稳健比较。
- 转化研究： 在神经元模型中，促进线粒体超微结构变化与疾病相关表型之间的关联分析。
- 企业级复用： 提供可重复使用的成像与分析工作流程，适用于神经元及其他细胞系统中的线粒体研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高线粒体靶点验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：为活细胞超微结构分析提供标准化、可重复且可扩展的成像工作流程。
- 战略价值：通过在研发早期提供高内涵、定量的数据，支持决策推进或终止项目，提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的优先排序，推动以线粒体健康为靶向的神经退行性疾病项目进展。
实施注意事项
- 需要具备活细胞超分辨率显微镜技术及图像分析的专业知识。
- 需要使用先进的受激辐射损耗（STED）仪器及兼容的图像处理软件。
- 需要跨团队统一成像参数和分割分析流程的标准。
- 在不同神经元和非神经元模型间应用时，可能需要优化实验方案。
- 技术局限性包括需要精确校准，以及活细胞成像中潜在的光毒性问题。
