使用随机微晶种子矩阵筛选法对蛋白质晶体进行I3C衍生化

本方案是一种结晶实验流程，旨在优化蛋白质晶体的生长，同时利用相位分子对蛋白质进行衍生化，从而通过X射线晶体学确定蛋白质的结构。为了确定一种全新蛋白质的X射线晶体结构，需优化结晶条件以获得高质量的晶体。对于一种全新的蛋白质，需要将重原子引入晶体中，以生成可用于结构解析的衍生化晶体。

从衍生化晶体中收集X射线衍射数据，并需通过计算求解以获得X射线晶体结构。结晶和衍生化均为耗时费力的过程。为解决这些瓶颈问题，我们设计了一种优化的筛选流程，可同时实现这两个目标。

本方案采用了一种先前开发的技术，称为随机微晶种子矩阵筛选法。将晶体或晶状沉淀物研磨成微晶种子，可用于在完全独立的条件下启动晶体生长。同时，我们将一种名为 I3C 的衍射相位分子引入结晶条件中。

该分子可提供强的反常散射信号，从而能够通过单波长反常散射相位法解析结构。对于不熟悉晶体结构实验测定的用户，我们提供了一套用户友好的软件流程，可部分自动化地完成结构解析，并针对利用I3C的反常信号进行优化。第一步是制备I3C储备液。

取120毫克I3C加入微量离心管中。向微量离心管中加入200微升2摩尔的氢氧化锂。可在40至60摄氏度加热并涡旋以促进溶解。

1摩尔的碘化锂I3C储备液应呈棕色。将I3C加入蛋白储备液中有两种方法。可将碘化锂I3C直接加入蛋白储备液中。

可将3.75微升至30微升的I3C加入150微升蛋白质中，使终浓度达到5至14毫摩尔。某些蛋白质在接触高浓度I3C时可能发生沉淀。在此情况下，可将碘化锂（lithium I3C）加入与样品蛋白质缓冲液相匹配的蛋白质稀释缓冲液中，终浓度为10至80毫摩尔。

向150微升蛋白质样品中加入150微升蛋白质稀释缓冲液。用于压碎晶体的玻璃探针由玻璃巴斯德吸管制成。使用本生灯的蓝色火焰，加热巴斯德吸管的中部位置。

使用一对镊子，将巴斯德移液管的末端拉成直径小于0.3毫米的细管。将该部分置于火焰中加热，使移液管在此处断开，并将末端烧圆，以完成玻璃探针的制作。此图为玻璃移液管应有的外观示例。

也可从第三方供应商处订购晶种悬液，以替代自行制备。通过研碎蛋白质晶体或晶状沉淀物来制备微晶原液。将五个1.5 mL微量离心管置于冰上。在光学显微镜下，挑选出形态最佳且可用于牺牲的晶体或晶状沉淀物。

对于96孔结晶板，通过切割塑料密封带打开孔。对于悬滴板，可用镊子取下盖玻片，并将其倒置在平坦表面上。转移70 µL储液至其中一个微量离心管中，并置于冰上冷却。

向其余的离心管中转移 90 微升储液溶液，并放回冰上冷却。如果储液体积不足，可通过混合相应的试剂配制结晶储液，并替代使用。使用玻璃探针搅动结晶液滴中的晶体，彻底将其碾碎。

可在显微镜下监测反应进程，直至观察不到任何晶体或结晶物质。将液滴中的全部液体转移至含有 70 µL 储液的微量离心管中。通过上下吹打混匀。

将两到三微升混合液转移回孔中，通过上下移液冲洗孔。再将混合液转移回微量离心管中。此冲洗步骤应再重复一次。

从此时起，应始终保持微型离心管处于低温状态，以避免微晶融化。将离心管在4°C下以最大速度涡旋震荡约3分钟，并定期将管子置于冰上冷却，以防止过热。通过将10 µL依次转移至预冷的储存液中，对晶种储备液进行10倍系列稀释。

在稀释种子储备液之间，应将试管涡旋振荡。不立即使用的种子储备液应保存在-80 °C超低温冰箱中。可使用液体分配机器人设置96孔随机微晶种子矩阵筛选实验。

将种子储备液、添加了I3C的蛋白储备溶液以及结晶筛选试剂放入机器人系统中。使用机器人从结晶筛选试剂中转移75微升至96孔板，其中1微升加入到结晶液滴中，74微升加入到储液池中。

将1微升添加了I3C的蛋白质溶液转移至结晶液滴中。将0.1微升的晶种储备液转移至该结晶液滴中。使用封板膜密封板孔。

可在24孔悬滴结晶板中设置悬滴筛。将悬滴孔的边缘涂抹油脂。向储液池中转移500微升结晶溶液。

在玻璃盖玻片中心附近放置一微升结晶溶液液滴。向此液滴中加入一微升含有碘化锂I3C的蛋白质溶液以及0.1微升的晶种储备液。将盖玻片翻转，通过将盖玻片压入油脂中密封结晶孔。

悬滴法和密封滴法的培养板需在恒定温度下孵育，以促进晶体形成。应定期在显微镜下检查晶体生长情况。在按照随附书面实验方案完成衍射数据的采集、积分与标度处理后，可使用 Auto-Rickshaw 自动化晶体结构解析流程来解决相位问题并建立蛋白质模型。

在 Auto-Rickshaw 登录页面，点击“继续”按钮。在 Auto-Rickshaw 网络表单中输入您的机构邮箱，然后点击“继续运行 Auto-Rickshaw”。对于没有同源性模型模板的蛋白质，请以高级模式运行 Auto-Rickshaw 的 SAD 协议。

输入所需的参数。选择蛋白质作为分子类型。以埃为单位输入数据收集波长。

因此，选择碘原子作为亚结构元素。选择 I3C 亚结构类型以表明 I3C 是用于定相的分子。选择 sub_direct 作为亚结构测定方法。

选择每个单体预期的子结构数量为三。将子结构搜索的保留阈值设为一。这将允许 Auto-Rickshaw 自动确定合适的分辨率截断值。

输入单个单体中的残基数、数据集的空间群以及根据马修斯系数确定的非对称单元中的分子数。选择适合您需求的X射线数据公开级别。将反常数据输入为空的数据集文件。

请以 SEQ、PIR 或 TXT 文件格式输入您的蛋白质序列。请输入您的机构邮箱地址。结果将通过发送至您提供邮箱的网页链接传送给您。

如果Auto-Rickshaw未能解析结构，可通过验证其确定的子结构来辅助排查结构解析问题。从Auto-Rickshaw结果页面下载重原子位点列表，该列表为一个名为“heavy atom sites”的超链接。

这将下载一个包含重原子位点的文本文件。将文件的扩展名从 txt 更改为 pdb。在 Coot 中打开该 pdb 文件。

打开对称性以查看来自相邻不对称单元的所有重原子。测量重原子之间的距离，包括跨越不对称单元的距离。I3C 将呈现为边长六埃的等边三角形。

出现具有这些尺寸的三角形表明这些重原子的位置是正确的。如果 Auto-Rickshaw 运行得到的子结构不正确，可按照书面实验方案中所述测试其他 Auto-Rickshaw 参数设置。I3C RMMS 方法已在两种蛋白质上进行了测试：一种是使用 Hampton Research 的高通量筛选法获得的鸡蛋清溶菌酶，另一种是来自噬菌体 P68 的 Orf11 溶菌蛋白结构域。

为每种蛋白质设置了完整的筛选板，分别对应不含I3C或微晶种的对照筛选板、添加微晶种的筛选板、添加I3C的筛选板，以及同时添加I3C和微晶种的筛选板。在结晶筛选中加入I3C似乎并未增加结晶成功的条件数量。对于溶菌酶（hen egg white lysozyme），成功结晶的条件数从31种减少至26种。

在对照筛选中，Orf11结构域仅发现一个结晶条件。在筛选中加入I3C后，相同条件下也仅得到一个结晶条件。向孔中加入微晶种子后，结晶条件的数量显著增加，分别使溶菌酶和Orf11结构域的结晶条件数量增加了2.1倍和6倍。

该结果与其他测试RMMS的研究一致。最重要的是，在筛选中加入I3C和微晶种子后，相较于对照筛选，鸡蛋清溶菌酶和Orf11结构域的命中条件数量分别增加了2.3倍和七倍。这表明I3C RMMS方法能够高效地为衍生化晶体产生新的结晶条件。

通过这些条件获得的晶体可用于解析晶体结构。利用I3C RMMS筛选法对晶体进行成功衍生化后，可通过Auto-Rickshaw流程中的SAD相位法解析出鸡卵清溶菌酶Orf11结构域的结构。本文展示了一种简单高效的方案，用于制备高质量且与相位分子I3C衍生化的晶体。

它减少了筛选用板和晶体操作步骤的数量，因此对于研究新型蛋白质的结构生物学家尤为适用。我们强烈建议通过测试在制备晶种储备液过程中配制的不同稀释度的晶种储备液来优化晶体尺寸。此步骤在完成初步筛选后进行。

I3C 广泛可得，且购买成本低廉，因此我们认为该方法适用于大多数结构生物学实验室。