从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

本方法的总体目标是获得可结晶并产生衍射的毫克级外膜β-桶状蛋白质。该方法有助于解答膜蛋白折叠与转运领域的关键问题，例如β-桶状蛋白质如何插入细胞膜。该技术的主要优势在于其对β-桶状蛋白质具有良好的稳健性。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为纯化、结晶和衍射过程中去垢剂的选择具有挑战性。除我本人及实验室同事外，来自苏珊·布坎南（Susan Buchanan）实验室的博士后杰里米·盖林（Jeremy Guerin）也将演示该实验流程。请首先构建一个含有密码子优化的目标外膜蛋白（OMP）基因的 T7 表达载体，用于在体内将目标蛋白表达至细胞膜，具体操作详见文字版实验方案。

将构建体转化至表达菌株中进行表达：吸取1 µL质粒加入50 µL BL21(DE3)化学感受态细胞中，轻轻吹打混匀。冰上孵育30分钟。孵育后，将样品置于42 °C水浴中热激30秒，然后重新放回冰上静置1分钟。

加入1毫升预热的SOC培养基，在台式摇床培养箱中于37摄氏度、1000转/分钟条件下振荡培养1小时。培养结束后，取100微升菌液涂布于含有适当抗生素的LB琼脂平板上，倒置后于37摄氏度过夜培养。随后，挑取单菌落接种至5毫升含抗生素的LB培养基中，进行小规模表达验证实验。

重复操作五到十个菌落。在37摄氏度下振荡培养，使菌液在600纳米处的光密度达到约0.6。向每根培养管中加入5微升1摩尔的IPTG，诱导目标外膜蛋白（OMP）表达，并继续培养一至两小时。

为了比较所有菌落的表达水平，使用微量离心机将每种培养物各一毫升在15,000 ×g条件下离心一分钟。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于200微升1× SDS-PAGE上样缓冲液中。在100摄氏度加热五分钟，然后再次于15,000 ×g离心五分钟。

使用移液器将20微升样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的每个加样孔中，凝胶浓度为10%。在200伏恒定电压下电泳35分钟。最后，以6000 × g离心10分钟收集细胞。

按每克菌泥加入5毫升裂解缓冲液的比例重悬细胞。使用高压破碎仪或细胞匀浆器裂解细胞。随后，在4°C条件下，以15,000 × g离心30分钟，去除未裂解的细胞和细胞碎片。

将上清液转移至洁净离心管中，在4°C条件下以高速再次离心一小时。所得沉淀即为含有目标蛋白的膜组分。使用Dounce匀浆器重悬膜组分。

首先，转移膜组分，然后加入不含去垢剂的2倍浓度溶解缓冲液。将重悬的膜组分倒入量筒中，并加水至溶解缓冲液的终浓度为1倍浓度。将样品转移至烧杯中，并缓慢加入去垢剂，使其终浓度约为临界胶束浓度的10倍。

然后，根据目标蛋白从膜中提取的难易程度，在 4 摄氏度下搅拌 0.5 至 16 小时。最后，在 4 摄氏度下以 300,000 ×g 离心溶解后的样品 1 小时。准备一个 1 至 5 毫升的 IMAC 柱，或使用预装柱。

在 4 摄氏度下进行后续层析步骤。用纯水冲洗以去除任何防腐剂残留。若使用自动化纯化系统，请根据制造商的说明安装色谱柱。

配制500毫升不含咪唑的IMAC缓冲液A和250毫升含1摩尔咪唑的IMAC缓冲液B。用10个柱体积的IMAC缓冲液A平衡IMAC柱。向蛋白样品中加入咪唑，使其终浓度为25毫摩尔，并混匀。然后以每分钟2毫升的流速将样品上样至已平衡的IMAC柱中。

收集流穿液。随后，用缓冲液B分别以五倍柱体积、浓度递增的咪唑溶液洗涤IMAC柱，每次洗涤液收集为2毫升的组分。最后用250毫摩尔浓度的咪唑溶液洗脱样品，洗脱体积为五倍柱体积，并将洗脱下来的样品收集为2毫升的组分。

使用 SDS-PAGE 分析方法，基于 280 纳米处的吸光度分析流穿组分、洗涤组分和洗脱组分。根据 SDS-PAGE 分析结果，合并含有目标 β-桶状外膜蛋白（OMP）的组分。随后，向合并的样品中加入 TEV 蛋白酶，并在 4 摄氏度下轻轻振荡孵育过夜，以切除 6X 组氨酸标签。

再次将样品蛋白酶溶液上样至IMAC柱，以分离目标β-桶状外膜蛋白与已切割的标签及任何未切割的样品。流出液将含有缺失标签的切割后样品。为准备结晶，将样品上样至凝胶过滤柱，并使用含有拟用于结晶的去垢剂的缓冲液进行平衡。

收集1毫升的洗脱组分，并根据其在280纳米处的吸光度，通过SDS-PAGE分析进行检测。合并含有目标蛋白的组分，然后浓缩至约10毫克/毫升。在制备样品前，组装凝胶装置。

使用预冷的凝胶电泳缓冲液或在低温室中进行凝胶电泳。采用0.22微米离心滤膜过滤样品，以去除颗粒物和沉淀。然后，用移液器将0.25微升样品分别加入两个1.5毫升微量离心管中。

将其中一个标记为“boiled”，另一个标记为“RT”。接着，向每个试管中加入9.75 µL的上样缓冲液，并用移液器吹打混匀。再向两个样品中各加入10 µL的2X SDS上样缓冲液，轻轻吹打混匀。将标记为“boiled”的样品在95°C下煮沸5分钟，而标记为“RT”的样品则置于室温下保存。

然后，将煮沸的样品短暂离心。接着，取20 µL上述两种样品加入预先制备好的非变性凝胶中。在恒定150伏电压下电泳60分钟后，取出凝胶并浸入染色液中以显示结果。

使用已发表的 JoVE 方法，在去垢剂、双细胞和脂质立方相中进行结晶试验。在紫外显微镜下观察结晶头部，以确认晶体确实是蛋白质晶体，而非盐、脂质或去垢剂晶体。采用实验室X射线源或同步辐射对初选晶体进行筛选，以判断晶体是否具有衍射能力。

在完成对衍射良好的晶体的数据收集后，使用数据处理软件（如 HKL2000）处理数据。将所得文件转移至结构解析软件套件（如 Phoenix Suite），并进行分子置换以实现初始相位确定和结构解析。YIUR 的晶体结构即通过此方法在 2.6 埃分辨率下确定。

一旦掌握，该技术可在两周内完成，前提是操作得当。观看本视频后，您应能充分理解如何表达并纯化细菌外膜蛋白，以用于结构研究。