高通量蛋白质结晶的微透析方法 via Microdialysis

透析结晶法是一种尚未被充分利用的方法。本方案提出了一种该方法的创新应用，将拓展当前可用于结构解析的结晶策略范围。该技术的主要优势在于通量高、操作简便，无需特殊设备，且便于对晶体生长过程进行实时监测。

操作本技术的人员必须熟练掌握微量移液操作以及多通道移液器的使用。移液时应尽可能准确，以防止样品部分脱水。为设置微透析实验，将市售的96孔微透析板以蛋白质面朝上的方向放置，并通过剥离200微米压敏胶间隔层，移除其上的粘性覆盖膜。

剥去粘性封口膜后，注意观察A1孔的位置。接下来，使用多通道移液器将最多3.2 µL已正确制备的蛋白样品加入每个孔中。将200 µm厚的紫外透光封膜正确覆盖在96孔板上，确保封膜朝上。然后，使用封膜压板按压紫外封膜，以激活并密封其压敏胶层，并检查密封完整性。

现在，将平板倒置，使缓冲液面朝上，并注意标记的A1孔位置呈镜像。使用多通道移液器，向平板的每个孔中加入最多350 µL透析液，并用储液盖膜小心密封各孔。随后，将平板以缓冲液面朝上的方向置于20 °C的合适温控培养箱中，以促进晶体生长。为在显微镜下观察晶体形成，需移除200 µm紫外盖膜的保护膜，然后将平板置于目镜下方，使蛋白质面朝上。

为了进行大规模结晶实验，需采用在微透析板中产生微晶的条件，并在大型容器中复制相同的条件。根据透析液的体积选择容器的大小。在使用红色塑料盖密封透析管之前，向透析管中加入最多500微升的蛋白质样品。

将密封的500微升透析管放入盛有透析液的容器内漂浮架中。接着，将容器置于20摄氏度的适宜温控培养箱中静置，以促进晶体生长。为检查晶体是否形成，用移液器吸取1至2微升透析管内的溶液，滴加到玻璃盖玻片上进行观察。

用另一块盖玻片覆盖载玻片上的溶液，并在显微镜下观察。使用体视高倍显微镜拍摄的图像显示，利用截留分子量为10千道尔顿的透析膜板，成功实现了四种蛋白质的微晶形成。溶菌酶在pH 4、含有适当添加剂的0.1摩尔醋酸钠缓冲液中透析时，形成了晶体。

当在pH 6.6、含有适当添加剂的0.1摩尔双-Tris丙烷缓冲液中进行透析时，Domatin形成了晶体。优化的透析条件促使膜蛋白形成微晶，这些膜蛋白包括大肠杆菌多药外排泵蛋白AcrB和大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY。利用微透析实验获得的优化透析条件，在透析管中进行大规模结晶，每种蛋白均生成了数千个微晶。

对于fomitin的结晶，将250微升蛋白质溶液对50毫升透析液进行透析。对于AcrB，将250微升蛋白质溶液对25微升透析液进行透析。LacY的结晶也采用相同比例设置，即100微升蛋白质溶液对10毫升透析液。

将板倒置使缓冲液面朝上时，需注意 A1 孔的位置，以便相应地分配结晶筛中的溶液。通过该方法获得的晶体可用于后续应用，如序列晶体学和微晶电子衍射（micro ED）。