基于电穿孔的Odonata目昆虫RNA干扰方法

本视频介绍了一种在蜻蜓目昆虫中通过电穿孔介导的RNA干扰方法的实验方案。蜻蜓和豆娘属于蜻蜓目，是现存最原始的昆虫类群之一。成年蜻蜓目昆虫在体色和斑纹上表现出显著的多样性，已有大量关于其生态学和行为学的研究。

然而，关于蜻蜓目的分子遗传学研究一直较为缺乏，因为基因功能分析非常困难。例如，传统的RNAi方法在蜻蜓目物种中无效。最近，我们建立了一种结合体内电穿孔的RNAi方法。

本文提供了一种通过电穿孔介导的RNA干扰技术，在蜻蜓和豆娘中进行基因沉默的视频实验方案。作为代表性豆娘物种，我们采用蓝尾豆娘Ischnura senegalensis。

这是最常见的豆娘物种之一，常发现于日本阳光充足的池塘中。首先，我们展示针对豆娘Ischnura senegalensis腹部的RNAi实验方案。在冰上麻醉后，将两枚针固定在前胸两侧，并将幼虫固定于固定架上。

使用镊子牵拉并拉伸第七和第八腹节之间的节间膜。用手保持节间膜处于拉伸状态。将制备好的毛细管尖端插入拉伸的节间膜中。

注射1微升siRNA或dsRNA溶液。使用镊子在幼虫体表施加两滴超声耦合剂。将电极置于超声耦合剂上，正极置于注射侧。

使用电穿孔仪产生10次电穿孔脉冲。用纸巾擦去表面残留的凝胶。移除昆虫针，并将处理后的幼虫置于湿润的纸巾上恢复约一天时间。

接下来，我们展示针对细腰亚目豆娘 Ischnura senegalensis 胸部的RNAi实验方案。在低温冰麻醉后，将两枚针固定在前胸两侧，并将幼虫固定于固定架上。用手牵拉并伸展前胸与合胸之间的节间膜。

将制备好的毛细管尖端插入拉伸的节间膜中。注射一微升 siRNA 或 dsRNA 溶液。使用镊子在幼虫表面施加两滴超声耦合剂。

将电极置于超声耦合剂上，正极置于注射侧。使用电穿孔仪产生10次电穿孔脉冲。用纸巾擦去表面残留的凝胶。

移除昆虫针，将处理后的幼虫置于湿润的纸巾上恢复约一天时间。作为代表性的蜻蜓物种，我们使用斑翅蜻蜓（Pseudothemis zonata）。

这是最常见的蜻蜓物种之一，常发现于日本阴凉的池塘中。最后，我们展示了以蜻蜓Pseudothemis zonata腹部为靶标的RNAi实验方案。拉伸第四和第五腹节之间的节间膜。

用细针在第四和第五腹节之间刺一个小孔。将制备好的毛细管尖端插入制备好的小孔中。注入一微升的siRNA或dsRNA溶液。

使用图钉将幼虫固定在固定架上。用镊子在幼虫表面滴加两滴超声耦合剂。将电极置于超声耦合剂上，正极置于注射侧。

使用电穿孔仪产生10次电穿孔脉冲。用纸巾擦去表面残留的凝胶。移除昆虫针，并将处理后的幼虫置于湿润的纸巾上恢复约一天时间。

在此，我们选择黑色素合成基因 MCO2 作为目标基因，EGFP 或 bla 作为阴性对照目标。MCO2 对多种昆虫体表黑色形成至关重要。首先，我们展示在色蟌（Ischnura senegalensis）腹部的实验结果。

白色箭头指示电穿孔时正极电极放置位置所对应的黑色素沉着受抑制区域。通过siRNA处理和dsRNA处理均观察到色素沉着的抑制现象。RNAi表型的大小和位置在不同个体间存在显著差异。

未进行电穿孔时，未观察到RNAi表型，表明电穿孔对该物种的RNA干扰至关重要。接下来，我们展示在均翅亚目塞内加尔丝蟌（Ischnura senegalensis）胸部的实验结果。同样地，在电穿孔后，正极电极放置区域周围出现了黑色色素沉积的抑制现象。

最后，我们展示了伪蜻（Pseudothemis zonata）腹部的实验结果。正如预期，RNAi 表型出现在电穿孔时正极电极所放置区域的周围。我们证实，电穿孔介导的 RNAi 方法在蜻蜓目（Odonata）中具有很高的应用价值。

在选择适当的发育阶段时，该方法几乎可以实现表皮中接近100%效率的局部基因抑制。与CRISPR/Cas9方法相比，该方法具有多项优势。

例如，通过电穿孔时正极的位置可以控制RNAi表型出现的区域，并且可以在同一个个体中并排轻松比较RNAi表型与对照表型。此外，该方法无需向微小的卵中进行显微注射，因此相较于CRISPR/Cas9方法，观察表型要简便且快速得多。

此外，该方法还可应用于那些新产卵难以收集的昆虫。例如，Pseudothemis zonata 雌虫在飞行过程中产卵，因此极难收集其新产的卵。

我们预计，当传统的RNAi效率不高时，该方案可普遍适用于非模式生物。