使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

本方案详细介绍了使用酵母 MoClo 试剂盒组装多基因质粒的方法。该方法可便捷地克隆多种多基因组合，适用于构建大量相关元件的文库。

首先配制 Golden Gate 反应体系。加入每种 PCR 产物及入门载体各 20 飞摩尔，10X T4 连接酶缓冲液 1 微升，Esp3I 0.5 微升，T4 连接酶 0.5 微升，再加入重蒸水至总体积为 10 微升。

然后，进行克隆反应。通过热激法将整个反应混合物转化至DH5 alpha菌株或同等的大肠杆菌化学感受态细胞中。将细胞涂布于含有35 µg/mL氯霉素的LB平板上。

然后将培养板在37摄氏度下孵育过夜。16至18小时后，将培养板从培养箱中取出，并置于4摄氏度下约五小时，以使超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）充分发育，产生更强烈的绿色荧光。筛选培养板时，将其放置在紫外光或蓝光透射仪上观察。

含有 sfGFP 的菌落将在紫外光下发出荧光。绿色菌落为阴性，因为它们含有未被切割的质粒片段。白色菌落可能为阳性。

如果出现30%至100%的白色菌落，则表明克隆成功。构建一个中间载体，包含左侧连接子、sfGFP脱落片段、右侧连接子、酵母筛选标记、酵母复制起点，以及含有mRFP1、大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的片段质粒。按照文本稿件中所述进行克隆反应。

将整个反应体系转化至DH5 alpha菌株，然后将细胞涂布于含有50微克/毫升羧苄青霉素或氨苄青霉素的LB平板上。在37摄氏度下过夜培养。16至18小时后，从培养箱中取出平板。

培养皿中将同时含有淡红色和淡绿色的菌落。在 4 摄氏度下保存约五小时，以使 mRFP1 和 sfGFP 成熟。使用紫外光或蓝光透射仪识别含有潜在正确中间载体的绿色菌落。

将绿色菌落在含有羧苄青霉素的 LB 琼脂平板上划线，并于 37 摄氏度过夜培养。次日，将菌落再次在氯霉素平板上划线，并于 37 摄氏度过夜培养。在氯霉素平板上生长的菌落含有错误组装的质粒。

当中间载体成功构建后，继续进行转录单元的组装。这一四片段组装包含中间载体、启动子、CDS 和终止子。纯化质粒，记录其浓度，并将每种质粒稀释至每微升含 20 飞摩尔 DNA。

完成克隆反应后，将整个克隆反应体系转化至DH5 alpha或同等感受态大肠杆菌细胞中，并涂布于含羧苄青霉素的LBN琼脂平板上。随后在37摄氏度下培养过夜。16至18小时后，从培养箱中取出平板，置于4摄氏度环境中约五小时，以促进sfGFP的成熟。

使用紫外光或蓝光透射仪识别不发荧光的白色菌落，这些菌落含有潜在正确的转录单元。按照文本稿件中的描述构建多基因质粒的中间载体。然后将整个克隆反应混合物转化至DH5 alpha细胞中，并涂布于含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基上。

将培养板在37摄氏度下孵育过夜。进行基于红色和绿色的颜色筛选，然后将绿色菌落划线接种并在LB卡那霉素培养板上培养，以筛选如前所述的错误组装体。接下来，按照文本手稿中所述设置克隆反应，组装多基因质粒。

将整个连接反应体系转化至DH5 alpha细胞中，并涂布于LB卡那霉素平板上。在37摄氏度下过夜培养。随后按照先前所述方法进行蓝白斑筛选。

本方案用于构建一个整合型多基因质粒，以破坏 ADE2 位点。共组装了四个复制型和一个整合型多基因质粒。中间载体克隆中潜在正确菌落的比例为 1.83%。一旦中间质粒克隆完成，从该中间体组装多基因质粒的成功率为 93.77%。阳性白色菌落数量极少，表明多基因质粒的组装效果不理想。

转化酵母后，产生β-胡萝卜素和番茄红素的菌落在第3天长出。从每个平板上挑取4个菌落，划线接种至新鲜平板，再培养两天。通过紫外-可见光分光光度法提取并定量类胡萝卜素。

BTS1/ERG20 与仅含 ERG20 的菌株相比，可使β-胡萝卜素的产量提高35倍。同样，与仅含 ERG20 的菌株相比，含有 BTS1/ERG20 的菌株番茄红素的产量大约提高16.5倍。多基因整合型质粒用于破坏 ADE2 位点，可单独使用 gRNA 而不加辅助DNA，也可将多基因整合型质粒作为辅助DNA与 gRNA 一同使用。

经过三到四天后，在含有Nourseothricin的YPD平板上观察到红色菌落，表明ADE2基因已成功被破坏。在尝试该方法时，最重要的是在配制反应体系时准确测量DNA浓度，并仔细进行移液操作。该技术可使酵母代谢工程领域的研究人员对大量基因和启动子进行筛选，以实现产物产量的最大化。