2.5D 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

量化驱动三维活体组织中血管出芽的细胞力学机制仍然十分困难，但在再生医学领域取得进一步进展又必须克服这一挑战。本方案通过将二维定量方法的易用性与三维组织的代表性相结合，使该任务更易于实现。目前针对活体组织中血管新生出芽过程的细胞力量化方法，仅限于复杂且计算成本高昂的三维力推断技术。

本方案通过将牵引力显微镜技术应用于离体系统，在体外控制与体内相关性之间建立了桥梁，提供了一种易于使用且具有生理相关性的时空力学表征方法。2 Nav-D模型在保持生理环境的同时，允许对细胞力学进行定量分析，为研究驱动出芽型血管生成的力学机制提供了独特途径。首先，用移液器将120微升结合硅烷溶液加入玻璃底12孔板的每个孔中。

将培养板在室温下孵育一小时。孵育结束后，使用喷瓶以无水乙醇洗涤各孔三次，并用氮气吹干培养板。用移液器将11.5 µL新配制的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶混合物滴加至每个孔的玻璃底部。

将一个13毫米的盖玻片轻轻放置在每个液滴上方。聚合后，向孔中加入PBS。使用弯针轻轻将盖玻片从PAA凝胶上松解。

然后使用镊子从孔中移除盖玻片。在PAA凝胶上加入75微升溶于超纯水的1毫克/毫升磺胺沙帕溶液。将培养板置于365纳米紫外光下照射5分钟。

用 PBS 快速冲洗凝胶上的磺胺样品。随后用 PBS 将功能化的 PAA 凝胶洗涤两次，每次 10 分钟。在功能化的 PAA 凝胶上加入 50 微升胶原蛋白 4 溶液，于 4 摄氏度孵育过夜。

第二天，用 PBS 将凝胶洗涤两次，然后使其干燥五分钟。在凝胶表面加入 50 µL 内皮细胞生长培养基（ECG 培养基）。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育一小时。

首先，使用无菌外科镊子将盛有改良CREB溶液的运输瓶中的猪颈动脉转移至一个装有无菌PBS的大培养皿中。用外科镊子和手术刀去除颈动脉周围多余的组织。使用手术刀从动脉两端各切除两到三厘米，以去除靠近动脉分叉的区域。

使用精细的圆头镊子和手术刀，去除颈动脉周围的动脉筋膜。用镊子将清理好的颈动脉转移至一个盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的新的大培养皿中。将动脉切成宽度约为两毫米的环状片段。

然后将血管环转移至含有ECG培养基的预热小培养皿中，置于37摄氏度环境中。开始操作时，使用圆头镊子将猪颈动脉环从ECG培养基转移至盛有PBS的中等大小培养皿中。

使用圆头镊子和手术刀将血管环切成两半，然后将半环解剖成宽度约为两毫米的片状，制备成尺寸为2×2毫米的动脉片。用圆头镊子夹住动脉片背面，将内皮内衬面向PAA基质，置于PAA凝胶边缘。接着，在镊子辅助下，轻柔地将动脉片移至PAA水凝胶中央，避免接触凝胶表面。

在动脉片上加入50微升ECG培养基，同时确保液滴保留在凝胶上。使用圆头镊子将一片干燥的13毫米盖玻片置于PAA基质上的动脉片表面的培养基中。利用玻璃底培养皿的内缘轻轻放下盖玻片，直至培养基液滴在盖玻片下方铺展开来。

将组织置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育5小时，使其贴壁。随后，向每个孔中加入1毫升ECG培养基。将动脉片在PAA基质上于37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。

第二天，使用弯针小心地掀起盖玻片，并用镊子将其从动脉片上移除。用真空抽吸法去除孔内及周围组织的培养基，注意不要触碰组织。在每片动脉片上加入10 µL I型胶原凝胶混合物。在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时，使凝胶聚合。

孵育后，向每个孔中轻柔加入1毫升预热的ECG培养基。将培养板转移至37°C、5% CO₂的培养箱中培养24小时。当使用13毫米未经处理的盖玻片时，可观察到动脉片贴壁效率提高，且在移除过程中剪切力最小。

在2.5D系统中培养猪颈动脉24小时后，检查是否存在出芽性血管生成。若观察到出芽性血管生成，则更换ECG培养基，并将12孔板放入显微镜37摄氏度预热孵育箱内的载物台支架中。根据成像需求选择显微镜物镜。

使用相差成像设置曝光时间并调整焦平面。然后添加荧光通道以对荧光微球进行成像，并再次设置曝光时间。在样品中选择多个感兴趣区域，并为每个位置调整焦平面。

通过选择 5 到 20 分钟的时间间隔以及 4 到 24 小时的持续时间，确定所需的时间序列。开启聚焦系统，以在整个延时成像过程中保持稳定的聚焦。接下来进行牵引力显微镜实验时，在孔中加入含 5% SDS 的超纯水，静置数分钟，使向外生长的细胞脱落。

在每个选定位置获取PAA基质中荧光标记物的Z轴层扫图像，以获得荧光标记物的松弛状态作为参考图像。使用自定义的MATLAB代码，选择时间序列图像和参考图像进行图像处理，并定义分析参数。相对于最佳参考图像对时间序列图像进行对齐和裁剪，以实现精确分析。

通过分析荧光标记物在PAA水凝胶中的位移，执行粒子图像测速不对称性分析，比较时间序列图像与参考图像之间的差异。将图像测速不对称性分析设置为将图像划分为32×32像素的 interrogation windows（ interrogation 窗口），重叠度为0.5。最后，根据PAA凝胶的力学特性计算细胞牵引力。

在猪动脉组织的2.5D和3D模型中观察到细胞出芽的形成，呈现出类似血管生成的模式，而2D模型中未见出芽性血管生成。与较硬的PAA水凝胶基质相比，较软的PAA水凝胶基质促进了早期动脉出芽性血管生成，表明了基质刚度的影响。牵引力显微镜显示，细胞出芽结构在突起部位表现出拉力，沿出芽轴向则表现出推力，这些力学行为由前导细胞和跟随细胞共同驱动。