生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（SBF-SEM）

连续块面扫描电子显微镜技术为三维组织超微结构提供了前所未有的观察视角，能够解答以往无法实现或极难开展的众多科学问题。该技术可快速、可重复地生成三维数据集，同时最大限度减少组织充电效应和成像伪影。更重要的是，它能够实现每日自动采集数千幅图像。

常规透射电子显微镜可提供优异的细胞超微结构图像。然而，这些图像缺乏三维背景信息，可能难以解释。连续块面扫描电子显微镜则提供了这种三维背景，有助于解析复杂的过程。

尽管本方案具有可靠性和可重复性，但某些步骤需要精确操作，对本方法的成功至关重要。本视频将详细演示这些关键步骤。在用含有2.5%戊二醛和2毫摩尔氯化钙的0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液固定样品后，应将样品切成不超过2立方毫米的组织块，并用含有2毫摩尔氯化钙的0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液洗涤。

然后依次用铁氰化锇、硫代碳酰肼和四氧化锇对组织进行染色。四氧化锇孵育后，在4摄氏度下用1%醋酸铀酰水溶液处理组织过夜。次日早晨，将0.066克硝酸铅溶解于10毫升0.03摩尔的天冬氨酸溶液中，并用一当量的氢氧化钾将Walton铅天冬氨酸溶液的pH值调节至5.5。

将溶液在烘箱中预热后，用室温的双蒸水对组织进行五次洗涤，每次洗涤三分钟。随后将组织转移至60 °C预热的Walton铅天冬氨酸溶液中，在60 °C下孵育30分钟。孵育结束后，洗涤组织，并将其置于递增浓度的冰冻丙酮系列中进行脱水，接着在室温丙酮中孵育10分钟。然后将组织置于旋转平台上，用硬质树脂与丙酮按1:3比例混合的溶液中浸润4小时，随后在旋转平台上用树脂与丙酮按1:1比例混合的溶液中浸润8小时或过夜，最后在旋转平台上用树脂与丙酮按3:1比例混合的溶液中过夜浸润。

次日早晨，在旋转平台上于室温下将组织依次浸入新鲜的100%树脂中，分别进行4至8小时、过夜以及4小时的浸透处理。次日早晨，用木棒将少量树脂与炭黑粉末混合，直至树脂被粉末饱和但仍保持流动性，且不出现颗粒状。树脂的稠度应类似于浓墨，能够缓慢滴落且无可见结块。将组织样本置于硅橡胶模具中，并拍摄图像，以记录样本在树脂块中的方位，供后续参考。

将样品放置到位后，用硅胶模具尖端的碳黑饱和树脂覆盖组织，同时将标注实验信息和组织详情的标签置于模具中远离树脂的一端。随后，将模具倾斜放入65摄氏度的烘箱中，加热约一小时。当含碳黑的树脂充分固化后，从烘箱中取出模具，并从一个空孔开始，用透明树脂填充模具的剩余部分，注意确保标签仍清晰可见。

当样品被透明树脂完全覆盖后，将硅胶模具放回65摄氏度的烘箱中，保持水平放置，加热48小时，然后取出模具。为准备成像用的组织块，将包埋在树脂中的样本固定于切片机的卡盘上，使锥形端露出卡盘约5至6毫米。用固定螺钉将样本锁紧，并将样本置于加热灯下。

数分钟后，将样品台放入体视显微镜的固定架中，使用新的双刃剃须刀片沿组织块表面平行切去薄层，直至观察到组织；与不含组织的树脂部分相比，组织区域反光较少且颗粒感不明显。将一根铝制样品针固定在修整针夹持器上，并在其端面反复进行深度交叉划痕处理，以增大胶水粘附面积，从而更好地固定样品。将样品置于加热灯下，先用刀片垂直向下切入树脂块一至两毫米，随后进行第二次等深且与前一切口垂直的切割，以去除组织周围多余的树脂，使最终修整出的树脂块直径约为三毫米，高度为二至三毫米。

完成初步修块后，再次将样品块置于加热灯下预热，然后使用新的双刃剃须刀片，在已修整部分下方约一毫米处，以一次平稳的切割动作切去树脂块的顶部。将装有已切割铝针的修块针夹放入体视显微镜的针座孔中，并在针的端面上涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸盐胶水，确保胶水完全覆盖针面但不形成可见的弯月面。用镊子将修整好的组织块按压在样品针端面的中央位置，持续数秒钟，并让胶水静置数分钟使其充分固化。

待胶水完全干燥后，找到树脂块凸起部分上的组织，使用双刃剃刀将含有组织样本的树脂凸起部分修整至不超过一平方毫米的面积。缓慢而小心地尽可能去除多余的树脂，使树脂块在一个方向上略长一些，然后使用金属锉刀将组织样本所在凸起区域外的多余树脂向针的边缘方向修成斜面。在对样品块整个表面涂覆一层薄银漆和进行金溅射之前，清除制备好的样品表面的树脂颗粒和灰尘。

包埋后，修剪块面表面多余的银漆，并将安装好并修整过的组织块放入定制转移移液管的球状末端，移液管上应附有相应的标签。通过SBF-SEM成像，在成年小鼠角膜内已鉴定出一种无弹性蛋白的微原纤维束网络。该网络呈分层排列，纤维与角膜细胞密切相关，甚至位于角膜细胞表面的浅凹陷内。

应用该方案已促成发现了一类此前未知的中央角膜神经群体，这些神经在基质-上皮交界处与基底上皮细胞相融合。中央角膜的SBF-SEM成像揭示了角膜缘血管、神经束及其相关细胞的存在，这些结构可进行手动分割以实现三维重建。该成像过程存在一些潜在问题，包括像素驻留时间过长，可能导致后续图像出现波浪状扭曲；块面发生微小电子放电，导致线条对比度快速变化；因刀片损坏或刀刃积聚碎屑而在块面留下刀痕；在样本仍处于成像室时，电子束长时间聚焦于块面而产生伪影；组织固定不当，导致细胞结构与结缔组织分离；以及由于组织或树脂块内电荷积聚过多而导致图像跳过。

在切割组织块时，必须清楚了解组织在包埋块中的具体位置，以免意外修剪掉任何重要的样本区域。如果需要对特定的细胞结构或相互作用进行更高分辨率的成像，可以暂停成像，将样品从显微镜上取出，然后在超薄切片机上进行切片，以便在透射电子显微镜下观察。连续块面扫描电镜技术为生物组织提供了完全独特的观察视角。通过使用本方案，我们能够快速获取高质量的数据集，并拓展可研究的组织类型范围。