通过扫描透射电子断层成像技术制备与观察厚生物样品

本实验的总体目标是利用会聚束扫描透射电子断层成像技术，对厚生物样品进行具有景深恢复能力的三维重构。该方法可解决结构生物学领域中关于厚生物样品电子断层成像的关键问题。该技术的主要优势在于，图像可在会聚束模式下采集，且数据处理可在大多数专用于断层成像的软件中完成。

开始准备细胞培养样品时，将样品在5000 × g离心5分钟。在整个样品制备过程中均使用此离心参数。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升含有4%多聚甲醛和2%戊二醛的PBS溶液中。

将悬液在室温下孵育30分钟。离心混合物，弃去上清液，并用1毫升PBS分三次洗涤沉淀。使用相同的孵育条件和洗涤程序，将沉淀分别在1毫升PBS（含1%四氧化锇）和1毫升PBS（含2%醋酸铀酰）中孵育。

接下来，将样品冷却至4°C。通过在浓度逐渐增加的乙醇溶液中依次孵育，使沉淀脱水。在整个孵育、离心和洗涤过程中，保持样品温度为4°C。

将脱水的沉淀物重悬于1毫升纯乙醇中，在4摄氏度下孵育过夜。然后让样品恢复至室温，并进行离心。将沉淀物在室温下依次用浓度递增的环氧树脂溶液进行孵育。

最后一次洗涤后，将沉淀重悬于1毫升纯环氧树脂中，在室温下孵育过夜。离心样品，弃去上清液，然后将沉淀重悬于200微升环氧树脂与固化剂的混合液中。将悬液转移至包埋胶囊中。

将塑料包埋胶囊在60摄氏度下孵育48小时，以使树脂聚合。从孵育箱中取出胶囊，确认树脂是否已聚合。在包埋的样品上添加一层环氧树脂和固化剂，然后在相同条件下再次孵育胶囊。

将包埋在树脂中的样品倒置安装在样品夹中。将样品牢固地固定在超薄切片机的修块块上。切除样品周围树脂中的塑料包埋胶囊。

将暴露的树脂塑造成金字塔形状。然后将包埋胶囊和样品载台转移到超薄切片机的移动臂上。安装修块刀，并在显微镜引导下进一步修整成金字塔形。

将修块刀更换为组织学切片刀。在显微镜下调整包埋块的倾斜角度，使锥体与刀刃垂直。设定切片速度并切取样本。

切片后，将选定的切片转移至置于滤纸上的处理过的铜网上。让样品自然干燥，然后将样品装入电子显微镜中。为设计聚焦贯穿倾斜系列，首先计算电子束的景深以及样品的最大表观厚度。

根据这些数值，选择一个焦距间隔，并确定在最大表观厚度下对整个样品成像所需的焦步数。然后，在低倍率下找到样品内的目标区域。调整齐焦高度，使样品旋转时目标区域看起来不发生移动。

确保在整个倾斜范围内 ROI 始终可见。填写穿焦倾斜系列参数以进行自动图像采集，并获取图像。将图像序列导入图像处理程序，并在金字塔层级结构中对同一倾斜角度下采集的图像进行对齐。

通过叠加已对齐的图像，确定每个倾斜角度下的对齐位置。浏览图像堆栈，确保只有聚焦区域在图像间发生移动，并根据需要重新对齐图像。一旦确认整个样品范围内的对齐无误，便在高设置下合并各聚焦信息，从而生成每个倾斜角度对应一幅图像的图像序列。

根据局部最小值或标记物进行倾斜系列图像的对齐。进行三维重构并检查所得图像。如果重构图像显得模糊或变形，请重新对齐原始图像序列。

使用该方法对一例布氏锥虫（T. brucei）样本进行了成像和分析。在倾斜角度为零度时，可观察到鞭毛袋的多个细节。

在70度的较大倾斜角度下，采集的焦平面序列中的每幅图像只有一部分处于焦点范围内。该焦点位置在整个序列中会发生变化。通过合并这些处于焦点范围内的部分，可生成一幅具有更大焦内区域的单一图像。

当突出显示贯穿焦面倾斜系列的高频区域时，这种效果更加明显。高频信息覆盖了大部分合成图像，表明贯穿焦面倾斜系列已得到良好处理。一旦掌握，图像处理部分大约需要三到四个小时即可完成，具体时间取决于所选择的对齐和重建参数。

在尝试此操作过程中，重要的是要记住，最终重建的质量在很大程度上取决于先前对中测试的质量。观看本视频后，您应充分了解如何进行贯穿焦倾转系列图像的采集及其图像处理。