利用连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜进行的靶向研究

任何需要对复杂生物样品中特定感兴趣区域进行三维超微结构研究的生物科学项目均可采用此技术。该技术适用于SBF/SEM和FIB-SEM两种成像模式，其样品制备流程相同。微波处理的使用可显著加快样品处理过程。

尽管此处展示的是根尖样本，但本方案经过 minimal 调整后可适用于任何生物模型系统。在使用此工作流程进行 SBF/SEM 与 FIB-SEM 关联分析之前，操作者应熟悉各项独立技术。某些步骤的实际操作较为直观，但用书面文字描述则较为困难。

本实验操作将由本实验室的技术员 Peter Borghgraef 演示。首先，在琼脂平板上剪取固定好的拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗根尖，将两到三个根尖放入含有相同固定液的 Eppendorf 管中，于 4°C 下过夜固定。次日早晨，使用移液器将固定液替换为 pH 6.8 的 0.1 摩尔磷酸缓冲液，将 Eppendorf 管置于转速为 100 RPM 的旋转台上，洗涤 10 分钟。

然后用新鲜的磷酸盐缓冲液重复洗涤五次。在通风橱中，将管盖打开，置于微波炉内，用含0.1摩尔磷酸盐缓冲液（pH 6.8）配制的2%四氧化锇和0.2%钌红溶液替换磷酸盐缓冲液，对根尖进行后固定，并启动程序。随后弃去管中溶液，用双蒸水洗涤根尖两次，每次五分钟。

进行第三次和第四次双蒸水洗涤时，使用微波炉辅助洗涤。第一次40秒双蒸水洗涤结束后，将根尖样品从微波炉中取出，更换为新鲜的双蒸水。然后将样品重新放回微波炉中，继续程序运行。

接下来，将 0.1 克硫代碳酰肼加入 15 毫升离心管中的 10 毫升双蒸水中，配制 TCH 溶液。将离心管置于烘箱中，在 60 摄氏度下加热 1 小时以溶解。然后使用 0.22 微米针头滤器过滤 TCH 溶液。

立即将样本管中的溶液更换为过滤后的TCH溶液，并继续进行后续步骤。随后将样本浸入乙醇中，并放入微波炉内，依次经过50%、70%、90%浓度梯度脱水，再用100%乙醇处理两次。经环氧丙烷脱水处理后，向管中加入50%Spurr树脂，开始对根尖进行渗透，渗透时间至少为两小时。

在100% Spurr树脂中完成最后一次孵育后，将根尖放入包埋模具中，用新鲜的100% Spurr树脂充满模具，并在65摄氏度的烘箱中聚合36至48小时。首先，使用剃刀片将聚合后的样品粗略修整成一个薄块。将暴露组织的一面朝下，用导电环氧树脂将样品固定在金属针的中心位置，使组织与金属针接触。

将样品放入65摄氏度的烘箱中，使环氧树脂过夜固化。次日早晨，将金属针插入载具中，并使用剃刀刮去样品上多余的环氧树脂。为进一步修平样品表面，将带有金属针的载具装入超薄切片机的持样器中。

在超薄切片机中，使用玻璃刀或金刚石刀将包埋块侧面修整成金字塔形，并使其表面平整。确保包埋块表面已暴露出部分组织。然后将修整好的样品块放入溅射镀膜仪中，调节参数至铂金镀膜，厚度为2至5纳米，使样品表面覆盖一层薄薄的金属膜。

将载样台插入SBF-SEM显微镜中。将金刚石刀靠近样品表面，修除样品上部以去除铂层，并暴露部分组织。然后将加速电压设定为1.5至2千伏。

拍摄组织图像并设置成像流程。使用Fiji软件，选择文件、导入、图像序列，并定位图像堆栈以加载图像。根据论文要求调整图像后，通过滚动浏览数据集来检查图像对齐情况。

使用文件菜单下的保存命令，将对齐的数据集保存为 3D TIFF 文件。仔细分析数据集，确认其中是否包含感兴趣区域（ROI），并确保该区域包含回答生物学问题所需的信息。在图像序列的最后一幅图像上（即 SBF-SEM 显微镜中的当前块面），选择一个新的 ROI 用于 FIB-SEM。

再次镀铂后，将样品装入聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）中，使用二次电子探测器在15千伏和1纳安条件下，定位在块面SBR-SEM中已确定的兴趣区域（ROI）。利用聚焦离子束（FIB）束流和气体注入系统，移动并倾斜样品台，使样品上的兴趣区域位于FIB与SEM电子束的重合点。在兴趣区域上方的表面沉积一层1微米厚的铂保护层。

接下来，使用50至100皮安的低铣削电流，在铂沉积层上铣出细线，用于成像过程中的自动聚焦和三维追踪。然后使用30纳安的高铣削电流，在感兴趣区域（ROI）前方铣出一条30微米深的沟槽，形成供扫描电镜（SEM）电子束成像的表面。在对成像表面进行平整处理后，开始成像扫描，并在前50至100个切片期间监测过程的稳定性。

当系统运行平稳后，离开房间并确保房间内尽可能减少干扰。SBF-SEM 图像可提供组织的整体概览，揭示细胞的空间取向及细胞内连接情况。随后在新区域进行的 FIB-SEM 成像则可添加特定细胞和结构的高分辨率细节。

SBF-SEM 数据显示出非各向同性体素与各向同性体素的 FIB-SEM 数据在渲染上的差异。SBF-SEM 在表面呈现阶梯状效应，而 FIB-SEM 数据由于采用 5 纳米的切片，使得渲染效果更加平滑，各个切片完全融合于表面。本方案描述了对单个样品中某一独特区域的成像过程，任何偏离该操作流程的行为均可能导致样品损坏，从而无法重新定位目标区域。