源自患者的肿瘤外植体作为预测患者药物耐药性的“活体”临床前平台

患者来源的组织外植体是一种短期方法，可提供即时的药物反应数据，准确预测患者治疗效果。PD 平台能够在三维环境中检测药物反应，尽可能地模拟区域肿瘤的病理特征和组织结构。外植体有望为药物的代谢过程和作用机制提供新的见解，并有助于发现新的药效动力学生物标志物。

实验开始前，使用70%工业甲基化酒精溶液清洁所有手术器械。将25毫升预冷的新鲜培养基加入直径10厘米的培养皿中，并置于冰上。用镊子将样本转移至牙科蜡表面，然后使用两把皮肤移植刀将组织切成约2至3立方毫米大小的碎片。

将外植体转移至一个10厘米的培养皿中，并取六到九块组织放入含有1毫升10%未缓冲福尔马林溶液的离心管中，在室温下孵育24小时。在六孔板中，根据需要向每孔加入1.5毫升新鲜培养基，并将一个组织培养插入式培养皿放入每一孔中，使其漂浮于培养基表面。

将6至9个外植体放置于每个插入盘上，并在5%二氧化碳培养箱中孵育16小时，以促进恢复。次日，向新培养板的每孔中加入新鲜培养基和药物，同时设置一孔作为溶剂对照。

当所有药物处理溶液制备完成后，使用镊子将每个插入物转移至新的六孔板的各个孔中，在二氧化碳培养箱中孵育 24 至 48 小时。药物处理结束后，将组织块转移至含有 10% 甲醛的新六孔板中，并在每个组织块上方加入数滴 10% 甲醛，确保固定液完全覆盖组织，于室温下固定孵育 24 小时。

第二天，将适量的小型组织学海绵浸泡在70%工业甲基化溶液中，并将海绵放入组织学盒中。当所有海绵放置完毕后，将同一药物处理条件下的所有外植体转移至同一块海绵上，使每个外植体的药物处理面接触插入的海绵圆片。

在每个外植体上方再放置一块预先浸泡过的海绵，并合上盒盖以固定盒内的外植体。随后将盒体浸入70%工业甲基化溶液中，再进行组织学处理。扫描完成后，进行训练分析，将包含印章图像的扫描文件导入相应的分析软件中用于训练。

在单模式视图中，浏览图像并选择要分析的扫描图像以及具有内在荧光的扫描图像。当具有内在荧光的扫描图像显示在单个视图中时，点击自发荧光选择工具，在未染色组织区域绘制一个区段。点击编辑标记和颜色，并在每个荧光染料对应的框中输入标记名称。

单击“准备图像”以允许软件从所有已上传的图像中减去自发荧光的强度。单击屏幕顶部的“分割组织”步骤，打开组织分割训练窗口。在组织类别面板中，输入要分割的每个组织类别的名称。

单击“绘制”，在感兴趣的组织类别中围绕细胞群绘制区域。然后切换到下一个组织类别并绘制新区域。当所有训练区域都定义完毕后，使用“训练组织分割器”，并等待训练准确率稳定。

可能接近100%的值。单击“分割全部”以分割组织。在确认组织分割质量后，单击“细胞分割”并选择要分割的细胞组分。配置核组分时，使用典型强度滑块调整用于检测核像素的阈值。

预览窗口可提供实时反馈。若要分割细胞核像素的聚集体，在细胞核组分分割面板中，选择最能描述细胞核染色质量的按钮，并使用滑动条调整分割灵敏度。然后点击“分割全部”以对所有图像进行分割。

当所有图像完成分割后，在表型面板中添加待检测的表型列表，并在相应的文本框中输入表型名称。单击“编辑表型”以选择特定细胞，并在下拉菜单中选择对应的表型。完成训练选择后，单击“训练分类器”以评估每种表型的结果。

继续进行所有表型分析，保存项目后点击导出。选择批量分析选项卡，并在批量算法或项目框中加载该项目。为导出图像和表格，在导出选项中勾选所有复选框，点击添加幻灯片，并加载所有包含先前准备批次印章的图像。

然后点击“运行”，以开始对一个样本进行批量分析，并在数据采集完成后导出相应的结果。对经细胞活性标志物染色的非小细胞肺癌（NSCLC）离体组织进行多光谱成像，可实现对离体肿瘤微环境中单个细胞亚群的鉴定与表型分析，以及肿瘤组分和间质组分的识别。如示例所示，对细胞活性标志物染色的多光谱图像进行组织与细胞分割，可用于定量分析经感兴趣药物处理的患者来源离体组织中的细胞死亡与增殖情况。

例如，在本分析中，与经对照处理的肿瘤样本相比，在经纳武利尤单抗（Nivolumab）处理的肿瘤组织样本中检测到更多的死亡细胞。此外，如图所示，通过分析染色切片获得空间信息，可计算细胞间的距离。外植体还可用于广泛的原位分析或质谱流式细胞术，从而在保持样本三维结构的同时，实现数百种生物标志物在亚细胞分辨率下的同步检测。

PDs 可用于预测免疫治疗的疗效。例如，有可能区分对免疫检查点抑制剂敏感或耐药的病例，并研究介导这种差异的潜在机制。