通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体

我们介绍一种利用三维生物反应器从滑膜液间充质干细胞中大量制备符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的外泌体的实验方案。这些外泌体可用于外泌体生物学研究及临床关节炎治疗。本实验操作将由梁玉洁博士演示。

通过在4°C、1,500 × g条件下离心10分钟，开始从滑液中收集人源间充质细胞（MSCs）。离心后弃去上清液，并用10毫升PBS重悬细胞沉淀。将重悬的细胞在4°C、1,500 × g条件下再次离心10分钟，弃去PBS，然后用10毫升人源MSC培养基重悬细胞沉淀，细胞密度为5 × 10⁴ 个细胞/毫升，随后将细胞悬液接种至100毫米培养皿中。

将培养皿置于含5%二氧化碳的环境中，37°C条件下孵育。两周后，收集细胞培养上清液，通过流式细胞术鉴定滑膜液间充质干细胞（SF-MSCs）。操作时，将第三代（P3代）SF-MSCs经离心处理，条件为4°C、1,000 ×g离心5分钟。

然后，弃去上清液，收集细胞沉淀。接着，向细胞沉淀中加入400 µL封闭缓冲液，细胞浓度为5 × 10⁴，于室温静置15分钟。15分钟后，按前述方法离心细胞悬液，再将分离得到的沉淀重悬于100 µL 1× PBS中。

按照论文中所述，每管加入一微升单克隆荧光抗体（稀释比例为1:100），并将试管置于室温孵育30分钟。孵育结束后，用1×PBS洗涤细胞两次，再将细胞重悬于100微升1×PBS中。随后，使用流式细胞仪的红色和FITC通道检测最多10,000个细胞中的荧光染料。

为制备微载体，将0.75克干燥的微载体以每克50毫克的浓度在1×DPBS中溶胀并水合，室温下孵育至少3小时。然后倾去上清液，并用新鲜DPBS洗涤微载体5分钟。更换为新鲜的1×DPBS，使微载体浓度保持在每克50毫克，随后在121摄氏度、15磅/平方英寸压力下高压灭菌15分钟，以实现微载体的灭菌。

然后，让灭菌后的微载体自然沉降，再倾去上清液。在室温下，用培养基以每克培养基含50毫克微载体的浓度冲洗微载体。待微载体沉降后，弃去上清液。

为准备灌注式生物反应器，按照前述方法通过高压灭菌对生物反应器进行灭菌。完成后，计数SF-MSCs细胞数量，并将2.5 × 10⁷个SF-MSCs及微载体加入装有250 mL GMP级MSC培养基的灌注式生物反应器中。将生物反应器置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中，以每分钟15转的速度培养。

每六天更换一次培养基。14天后，收集细胞培养上清液和微载体用于进一步分析。在4摄氏度条件下，以300 × g离心细胞培养上清液10分钟，收集上清液并弃去细胞碎片。

在 4 摄氏度下，将上清液依次以 2,000 × g 离心 10 分钟，然后以 10,000 × g 离心 30 分钟，以去除较大的囊泡并收集沉淀。将沉淀重悬于 40 毫升 PBS 中后，在 4 摄氏度下以 120,000 × g 离心 70 分钟。随后，将含有外泌体的沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。

用无菌 PBS 将 freshly isolated 的外泌体样品稀释至每毫升 10⁷ 到 10⁹ 个颗粒的浓度，每次运行向纳米颗粒追踪分析（NTA）系统注入 500 微升样品，流速为每分钟 30 微升，温度为 24.4 至 24.5 摄氏度。根据制造商的操作说明，手动设置捕获与分析系统。通过激光散射观察颗粒，并以数字视频记录其布朗运动。

接下来，使用软件分析录制的视频，每次运行需追踪至少200个单独的颗粒。进行蛋白质印迹时，向外泌体中加入300微升裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合液，通过上下吹打混匀。然后将样品置于冰上静置20分钟。

在4 °C条件下，将混合物于9,391 ×g离心10分钟，随后使用蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。检测完成后，加入100 µL 4×蛋白上样缓冲液，在100 °C加热样品10分钟。接着，取15 µL浓度为10 mg/mL的蛋白样品，以120伏电压进行70分钟凝胶电泳，随后在4 °C条件下以100伏电压电转印60分钟。

通过荧光Western印迹检测非外泌体特异性标志物（如钙网蛋白）以及外泌体生物标志物（如CD9、CD63和CD81）。在该研究中，采用流式细胞术鉴定滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）的表面标志物。流式细胞术分析显示，培养的SF-MSCs对CD34、CD45和HLA-DR呈阴性，对CD73、CD90和CD105呈阳性，符合间充质干细胞的鉴定标准。

在倒置显微镜下观察发现，丝素蛋白-间充质干细胞（SF-MSCs）可在微载体上增殖。自第6天起，SF-MSC在3D培养中的增殖速度较2D培养更快。通过蛋白质印迹法鉴定2D和3D培养条件下SF-MSCs分泌的外泌体，结果显示外泌体表达CD63、CD9和CD81，而不表达钙网蛋白（calnexin）。

纳米颗粒分析显示，二维和三维外泌体的直径约为120纳米。透射电子显微镜分析揭示了二维和三维外泌体的形态，呈现出大致球形的囊泡结构。通过NTA分析，对外泌体中30至160纳米尺寸范围的颗粒浓度进行了检测。

经过3D培养后，颗粒浓度为每毫升4.0 × 10⁶。然而，经过2D培养后，相同尺寸颗粒的浓度为每毫升2.5 × 10⁶。此外，3D培养产生的外泌体蛋白多于2D培养。

代表性分析显示，Dil标记的外泌体被原代软骨细胞内化。可见Dil标记的外泌体在3小时达到峰值，进入原代软骨细胞。体外递送研究表明，外泌体可将磺化氰3标记的microRNA-140递送至软骨细胞。

接种细胞、启动生物反应器中的反应以及上清液的收集是本方案中最重要的步骤。三维培养常用于贴壁细胞的大规模培养。其他方法如旋转式生物反应器也可用于外泌体的大规模生产。

我们的方法提高了外泌体的产量，从而实现了基于间充质干细胞外泌体的临床前应用。