人脂肪源性间充质干细胞来源的细胞外囊泡的纯化与表征

我们的研究重点是从人脂肪来源的间充质干细胞中制备和纯化细胞外囊泡。我们希望解决的问题是如何标准化这一过程并提高纯化效率。目前，有许多技术可用于提取细胞外囊泡，例如超速离心法、超滤法、体积排阻色谱法、聚合物沉淀法、免疫亲和捕获法、微流控技术等。

然而，超速离心法被公认为是金标准。未来，我们将致力于细胞外囊泡作为载体的应用研究，包括携带mRNA、质粒及其他小分子并将其转染入细胞。首先，从液氮中取出两支冻存管，内含第3代冻存的人脂肪来源间充质干细胞。

将它们置于37摄氏度水浴中振荡，直至完全解冻。然后使用75%酒精对管子进行消毒。将消毒后的管子放置于超净工作台上。

使用移液器吸取细胞悬液，并将其转移至15毫升离心管中。在低速离心机中以250 ×g、4 °C离心5分钟。同时，准备4个10厘米培养皿，每皿中加入9毫升培养基。

在每块培养皿上标记名称、细胞类型、代数和实验日期。然后，将其放入37°C恒温细胞培养箱中预热。五分钟后离心结束，将离心管移至超净工作台前需先进行消毒。

使用移液器吸除上清液，并加入 4 mL 培养基以达到所需细胞浓度。轻轻振荡溶液，直至细胞均匀分散。随后，将 1 mL 细胞悬液加入每个预热的培养皿中，并在水平台面上以十字交叉方式轻轻摇动培养皿，使细胞悬液混匀。

将培养皿放入37摄氏度培养箱之前，在光学显微镜下以40倍放大倍数观察细胞。第二天，在进行换液准备之前，于光学显微镜下以40倍放大倍数观察细胞状态。消毒后，将培养皿转移至生物安全二级的超净台中。

移除每个培养皿中的培养基，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）溶液轻轻冲洗培养皿两次，然后向每个培养皿中加入10毫升培养基。将细胞转移至培养箱中，直至准备收集上清液。

首先，在人脂肪来源的间充质干细胞培养达到80%融合度时，收集培养液上清。使用移液器小心收集上清液，并转移至50毫升离心管中。在室温下以300 ×g离心10分钟，以去除悬浮细胞。

然后，使用移液器吸取上清液，注意不要扰动沉淀。将上清液在4°C条件下以2,000 G离心10分钟，以去除细胞碎片。用移液器收集所得上清液，并通过0.22微米滤膜过滤，以去除大颗粒和细胞碎片。

将滤液在4°C条件下以10,000 G离心30分钟。然后，在4°C条件下以100,000 G进行最终离心，持续70分钟。使用移液器小心移除上清液，避免收集沉淀物。

将沉淀重悬于PBS中，然后在4°C条件下以100,000 G离心70分钟。弃去上清液，将获得的细胞外囊泡（EVs）沉淀重悬于1毫升PBS中。最后将EV悬液转移至1毫升离心管中，在4°C保存直至进一步分析。

透射电子显微镜清晰地揭示了细胞外囊泡（EVs）具有双层膜结构的杯状形态。纳米颗粒追踪分析表明，其粒径分布约为50至150纳米。蛋白质印迹分析显示，EVs的特征性标志蛋白得到良好表达。