四重棋盘法：一种用于药物组合研究的三维棋盘法改良技术

四重棋盘法是一种研究通过联合使用四种药物所能获得的所有可能组合的技术，对于寻找耐药微生物（主要是多重耐药菌，即 MDRs）的治疗方法具有重要意义。该技术不耗费大量人力，结果可在次日或培养期结束后获得。此外，该方法能够在一次实验中同时研究所有可能的药物组合，而不仅限于某些特定且极为有限的组合方式。

此外，该技术可应用于多个学科领域，而不仅限于微生物学。它可用于研究不同抗菌剂之间的所有可能组合，而不仅限于抗菌药物。除了微生物学领域外，该技术还可用于研究抗癌药物之间的组合、植物提取物与药物之间的组合，甚至分子水平有效治疗方案组合之间的相互作用。

将4个96孔板并排放置，形成一个正方形，并用胶带将它们的底部粘在一起。重复此步骤，制备四个面板，每个面板包含四个孔板，并将其命名为A1、A2、A3和A4。加入50 µL Mueller。

在四个面板的1696孔板中，向第2列至第11列的孔内加入提示液和肉汤。向H12孔加入200微升Mueller Hinton肉汤，作为阴性对照。在四个面板的1696孔板中，向A1孔和H1孔各加入50微升Mueller Hinton肉汤，作为阳性对照孔。在四个面板的1696孔板中，将药物一（头孢噻肟）进行系列稀释后加入15毫升锥形管中。无菌蒸馏水。

根据公式 C₁V₁ = C₂V₂ 计算需从药物储备液中取出的体积。从 15 ml 无菌蒸馏水中移除计算所得体积，并向锥形管中加入等体积的药物储备液。将配制好的药物溶液各 50 微升移入第 11 列和第 12 列的每孔中（H12 孔除外）。从第 11 列取 50 微升加入对应第 10 列的孔中，开始进行系列稀释，依次从第 10 列稀释至第 2 列，从第 2 列取出的 50 微升溶液将被弃去。对四块面板中的每一块 1696 孔板重复上述系列稀释操作。

将药物二阿米卡稀释液逐级稀释后加入一个10 ml的锥形管中。使用无菌蒸馏水。计算需从药物储备液中移除的体积。

从10 ml无菌蒸馏水中移除计算好的体积，并向锥形管中加入等体积的药物储备液。另取一块96孔板，在G行至B行的各孔中加入100微升无菌Mueller Hinton肉汤。在此板中，将先前配制的药物2溶液100微升加入G行各孔中。从G行到B行进行系列稀释，每次从G行各孔中吸取100微升转移至下一孔，依次操作，最终从B行各孔中弃去100微升。重复上述步骤，制备八块独立的96孔板；将药物2转移至四个板块时，使用移液器将50微升药物2从G行至B行的各孔中转移至每个板块对应孔中，一块已制备的96孔板中含有100微升药物2。

这足以用于一个面板中的两块平板药物实验。将三份腰肌组织分别加入四个不同的锥形管中，每管加入14 ml无菌蒸馏水。计算需从药物储备液中移除的体积。

从每支试管中移除计算好的体积的14 ml无菌蒸馏水，并加入相应体积的药物。在配制好第三种药物所需浓度后，取50微升加入对应板中B至G行、第2至第12列的相应孔中。每个面板中，C1对应四个P1板，四个面板C2对应四个P2板，四个面板C3对应四个P3板，四个面板C4对应四个P4板。对于第四种药物甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的添加，向一个锥形管中加入14 ml。

使用蒸馏水。计算需从药物储备液中移除的体积。从每支试管的14 ml无菌蒸馏水中移除计算好的体积，并加入所需体积的药物。

配制好第四种药物所需浓度后，取 50 微升加入 B 至 G 行、2 至 12 列之间的相应孔中。在对应的四个板中，C1 对应第一块板，C2 对应第二块板，C3 对应第三块板，C4 对应第四块板。使用无菌接种环转移，制备并加入等量 I-E-S-B-L 细菌接种物。

一个细菌分离株的单个菌落等同于先前在平板上培养的菌落，将其加入2 ml无菌的Mueller-Hinton肉汤中，并涡旋混匀。通过浊度检测，调整至0.5麦氏浓度标准，使用密度计。将适量无菌Mueller-Hinton肉汤加入无菌尿杯中，然后根据公式C₁V₁ = C₂V₂，将0.5麦氏浓度的细菌接种物加入尿杯，其中V₁为800微升。除H12孔（作为无菌对照）外，向其余各孔每孔加入50微升接种液。将微孔板于37摄氏度培养过夜。本图显示的是A1板。颜色变化的孔表示含有细菌生长的孔，黑色箭头指示有细菌生长的孔位。

第一、第二和第三块平板中均无生长界面。我们可以观察到，在第四块平板中，D行含有阿米卡星最低抑菌浓度（MIC）的八分之一，以及头孢噻肟和左氧氟沙星的多个亚MIC浓度，同时还含有甲氧苄啶-磺胺甲噁唑MIC的八分之一，该区域出现抑制现象。我们注意到，在含有该联合药物的象限中未见细菌生长。

这是因为在该孔板中，左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）能够完全抑制细菌生长。图一B代表第二组。在该组中，我们可以观察到在RD中也出现了细菌生长抑制现象，其中含有头孢噻肟和左氧氟沙星的亚抑制浓度，以及八分之一MIC的阿米卡星和四分之一MIC的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑。图一C代表第三组A。

在该图中，我们可以观察到在含有头孢噻肟和左氧氟沙星的多个亚最低抑菌浓度（sub-MIC）以及添加了甲氧苄啶-磺胺甲噁唑半量最低抑菌浓度（½ MIC）的C行和D行中，细菌生长受到抑制。其中，C行还含有阿米卡星的¼ MIC，D行含有阿米卡星的½ MIC。图1D代表面板A4。在该面板中，我们使用了1个最低抑菌浓度（1 MIC）的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，联合不同浓度的头孢噻肟、阿米卡星和左氧氟沙星。在该图中，我们可以看到，在包含该联合方案的象限中，细菌生长被完全抑制，这种抑制效应归因于1 MIC的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，在Excel文件的FIC指数表中均有体现。

该表格将显示最终的抑菌联合分数（FIC），并提供对所得数值的解释。总之，Q棋盘法可在一次实验中研究四种药物之间的所有可能组合。结果于次日获得，并可通过Excel模板以简便快速的方式进行解读。