基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

您好，我是 Eric Gottwald，是 Ware 研究所生物界面研究所的一名科研人员。今天，我将向您介绍我们的基于芯片的灌注式微生物活性系统。在将该芯片用于细胞培养应用之前，我们必须对聚合物进行水解，并对微结构区域进行脱模处理。

通过将芯片浸入不同浓度的异丙醇中即可实现这一过程，首先从100%浓度开始，将芯片在每种浓度中仅浸入数秒，最后一步是浸入水中。随后，将芯片干燥，最后必须用I型胶原溶液对芯片进行包被，以促进细胞在聚合物表面的黏附。该步骤通过在微结构区域表面滴加几滴I型胶原溶液完成，然后将芯片置于4°C条件下孵育过夜。

在胶原蛋白一溶液中过夜孵育后，移除溶液，并用无菌 PBS 洗涤芯片。随后，移除 PBS，芯片即已准备好用于细胞接种。接下来，我们将细胞悬液接种到细胞芯片上，具体操作是将 150 微升单细胞悬液直接加在微结构区域上方。细胞沉积后，将芯片置于 37 摄氏度的培养箱中孵育三小时。

经过三小时的孵育后，将芯片从孵箱中取出，即可准备插入ectro。操作时，将ectro从其无菌包装中取出，其无菌性通过该透明膜的γ射线辐照灭菌获得。因此，我们只需打开包装并取出ectro即可。

接下来，我们将瓶口插入该培养基储液槽中，以便拆卸生物反应器外壳，从而插入芯片。打开生物反应器外壳后，即可插入芯片，只需将芯片放入生物反应器外壳的凹槽中即可。随后可重新组装生物反应器。最后一步是将无菌过滤器连接至培养基储液槽，并连接一个无菌取样口。

为了测量封闭循环回路中的实际氧分压，我们将两个氧传感器直接安装在这两个连接件之间。生物反应器现在已准备好加入培养基。该生物反应器系统现已准备就绪，可注入细胞培养基，只需将封闭循环回路连接至蠕动泵即可完成。

通过此操作，我们将同时降低整个bactor循环系统的流速。正如您在此处的Ector窗口中所见，您可以看到培养基从下方不断上升，最终从bactor顶部流出。在将Bactor系统放入培养箱之前，我们需检查循环回路是否无气泡填充。

现在系统已完全充满细胞培养基，我们可以将生物反应器转移至培养箱中。接下来，我们将把生物反应器放入培养室。为此，首先需将生物反应器连接至蠕动泵（如您此前已短暂看到的），现在培养瓶中的培养基正主动灌注生物反应器。

为了维持环境中的氧气浓度，我们将培养基储液罐连接至气体供应系统。最后，我们将两个氧气传感器连接到循环系统，以在线监测系统中的氧分压。现在，装置已搭建完毕，只要实验设计允许，即可持续运行。

在分析 MicroCon 容器内细胞的器官样功能时，最强大的工具之一是激光扫描显微镜，您在此可以看到。激光扫描显微镜使我们能够在不破坏样本的情况下观察每一个单独的 MicroCon 容器内部。由于 MicroCon 容器或芯片可用于常规的免疫染色和免疫荧光方法，因此我们能够检测微容器内各种类型的标志物及器官样功能。

如您在此芯片动画中所见，MicroCon 容器的底部以及容器壁上已完全布满细胞。我们拥有大量活性良好的细胞，而死亡细胞则非常、非常少。下一张图片表明，我们能够在 MicroCon 容器内检测到各种类器官功能。

例如，对于肝细胞，可以观察白蛋白的产生或细胞中E的表达，如图中叠加图像所示。细胞核染成蓝色，E染成绿色，白蛋白表达或染色呈红色。

如您在此处清晰所见，从肝细胞预期的所有类器官功能均在此类三维培养中得到了良好表达。此外，我们还检测了另一种肝细胞标志物——细胞角蛋白18（cytokeratin 18），该图片显示，细胞角蛋白18 在此类培养物中同样得到了良好表达。希望这能让您相信，此类类器官功能也可能适用于其他类型的类器官培养。

在生物反应器实验结束后，该芯片可用于分离各种细胞组分，例如总RNA。如图所示，此处展示的是从生物反应器系统中分离得到的总RNA。该总RNA可进一步用于下游应用，例如实时PCR，或如图所示的微阵列分析。

此外，可以从该系统中分离出完整的细胞，并将这些细胞用于常规流式细胞术分析。正如您在此处所见，希望我们能够向您展示该系统可能适用于所有需要器官型反应的各类应用，同时也可能适用于迄今为止我们尚未考虑到的其他各类应用，例如干细胞应用。