基于共聚焦激光扫描显微镜的整装透明化小鼠肺组织中Aspergillus fumigatus分生孢子分布的定量分析

我们的方法能够对整体透明化小鼠肺组织中烟曲霉分生孢子的分布进行定量分析。烟曲霉分生孢子可侵入呼吸系统，并在免疫功能低下患者中引发危及生命的疾病。哺乳动物的呼吸系统是由不同级别的气道组成的系统。

每一代都具有不同的气道壁结构和免疫细胞群体特征。在支气管分支中，烟曲霉分生孢子可通过黏膜纤毛清除作用被清除。然而，在开放空间中，黏膜纤毛清除作用无法发挥作用，此时分生孢子必须由免疫细胞（如肺泡巨噬细胞和中性粒细胞）来清除。

分生孢子在气道中的时空分布特征对于理解疾病机制至关重要，但这一问题尚未得到充分研究。本文介绍了一种用于定量分析感染小鼠气道内烟曲霉分生孢子分布的实验方法。

将50微升标记的烟曲霉分生孢子施用于小鼠。六小时后，取肺组织。用2%甲醛固定过夜，并用标记的链霉亲和素偶联物染色。

然后对样本进行光学透明化处理。将样本放入装有50%甲醇水溶液的玻璃瓶中，置于室温下的样本混合器上处理1小时。随后将50%甲醇更换为100%甲醇，并在样本混合器下处理2小时。

配制一种混合液，包含一份苯甲醇和两份苯甲酸苄酯。将样本转移至24孔板中，并用苯甲酸苄酯混合液覆盖，孵育至少30分钟。样本即可用于成像。

将样品放置在样品台上，并将样品台放入显微镜中。打开显微镜系统并启动软件后，开启透射光源，并选择一个X物镜。

在透射光下目视定位您的样品，然后进入采集选项卡。选择共聚焦激光显微镜的Lambda模式。打开相应的激光器。

设置探测器的光谱范围并选择二向色镜。调节探测器增益，并将针孔缩小至一个面积单位。将像素分辨率设置为 512 × 512。

打开z轴层扫模式并开始实时成像。找到两个骰子均可清晰可见的焦平面。展开z轴层扫面板。

使用调焦旋钮，找到并选择样品的最低和最高焦平面。将焦平面定位在样品底部附近。关闭z轴层扫模式，开启光栅扫描模式。

如有需要，调整 X、Y 位置及图块数量。开启 z 轴层扫和扫描模式。将 z 轴切片步进设为 5 µm。

设置扫描速度。启动实验。成像通常需要数小时，具体时间取决于地块大小和扫描速度。

然后对获得的图像进行光谱解混。进行光谱解混时，使用线性解混选项。选择对应于用链霉亲和素和分生孢子标记的陆地区域。

开始解混。解混后保存解混文件。要拼接所得图像中的图块，请打开该图像。

选择方法，几何拼接。在输入窗口中选择图像。在拼接选项中，选择新建输出和融合图块选项。

使用参考模式，选择对应气道荧光的通道。在额外的3D视图中打开图像。如有需要，可更改其显示所用的颜色。

此处我们以灰色显示气道通道，以紫色显示分生孢子通道。要创建气道掩模，请使用“添加新表面”工具。选择气道通道，并设置平滑参数为 10 µm。

可以使用多种滤镜来排除气道外的信号。首先，目视检查表面并设置强度阈值。还可以应用其他滤镜（如表面积）以特异性选择气道，而不包括胸膜或血管。

接下来，手动删除不属于气道的选中表面片段。此时可以观察生成的表面，并检查其中缺失的部分，以便后续进行修正。使用“编辑”和“全选蒙版”选项为气道表面创建蒙版。

选择气道通道，并将表面外的工作单元设置为 0.001。此处我们以橙色显示生成的掩膜。将分生孢子通道和气道掩膜分别保存在两个独立的文件夹中，作为T of F序列。

使用气道面罩图像文件打开。将图像转换为二值图像。按照二值化处理流程，进行二值化处理。

为了模拟掩膜的厚度，应用多次三维膨胀功能。依次选择插件、处理、三维膨胀。您也可以使用宏功能来完成此操作。

经过数次膨胀处理循环后，使用填充孔洞功能。按以下步骤操作：二值化，填充孔洞。如需手动填充掩膜中的残余孔洞，请打开感兴趣区域管理器。

依次选择“分析”、“工具”、“ROI管理器”。使用多边形选择工具，在某一特定投影中选中需要填充的区域。在z轴堆栈中的多个投影上重复此操作数次，以便对感兴趣区域的形状进行插值。

要插值选定的形状，请先选择所有形状，然后点击“更多”，选择“插值 ROI”。接着将所有 ROI 填充为白色。再次使用“填充孔洞”步骤。

在填充孔洞后，为了重新恢复掩膜的厚度，请应用三维腐蚀（erode 3D）功能。依次选择插件、处理、三维腐蚀。您也可以使用微米单位进行此操作。

3D 腐蚀和 3D LA 中的迭代次数应相等。启动分生孢子计数应用程序。按下添加文件按钮，选择包含 DIFF 文件的文件夹，其中应包含已准备好的气道掩膜和分生孢子荧光图像。

在零到一之间设置自定义阈值。点击“确定”查看结果。采用此方法，我们在分生孢子施用后六小时对小鼠支气管内外的分生孢子进行定量分析。

数据表明，在初次给药后，大部分分生孢子会穿透肺泡腔，并在炎症免疫反应初期定位于此。利用共聚焦激光扫描显微镜对小鼠肺组织进行三维成像，可识别气道内的烟曲霉分生孢子。通过本方案处理三维图像，可对支气管内外部分生孢子的分布进行定量分析。

我们的方法还可用于估算分生孢子从鼠类气道中被清除的动力学过程，并比较免疫功能正常与免疫功能低下小鼠体内分生孢子的解剖学分布。此外，利用该方法还可分析微粒或纳米颗粒聚集体在气道中的分布情况。