使用活体显微镜和开源软件对Aspergillus nidulans生长速率进行定量分析

在本视频中，我们介绍了一种无需标记的活体成像方案，用于通过透射光显微技术获取模式真菌构巢曲霉（aspergillus nidulans）的图像。我们利用这些图像分析并量化构巢曲霉在液体和固体培养基中的生长动力学。该方案的可视化展示有助于使用者熟悉图像采集及显微图像处理的关键步骤。

测量丝状真菌生长的常用方法是在含有营养琼脂的培养皿中接种真菌孢子，数天后测量菌落的直径。然而，该方法的灵敏度不足以量化细微的生长差异。因此，开发了利用延时显微镜进行单细胞测量的方法。

这些测量不仅能够提供准确且定量的结果，还能反映群体内不同细胞的生长动态。此外，该方法旨在更深入地理解真菌生长对内源性和环境信号响应所涉及的分子机制。首先，将15毫升液体营养琼脂倒入培养皿中。

将盖子盖上并使其冷却。使用紫外线照射对培养皿进行灭菌。在划线接种目标真菌菌株之前，将接种环在本生灯上加热至红热，然后将接种环插入琼脂中冷却。

涡旋混匀试管，用接种环在添加了适当营养成分的琼脂最低培养基表面划线。于37摄氏度培养2至3天。使用无菌牙签，轻轻接触单个菌落，转移少量分生孢子至完全培养基平板上。

将平板在37摄氏度下孵育三至四天。用含有0.05%体积比吐温80的1.0毫升高压灭菌蒸馏水，在无菌的1.5毫升涡旋管中收集构巢曲霉的分生孢子，以减少分生孢子团块的数量。采用改良的倒置琼脂法对琼脂培养基表面的丝状真菌进行成像。

最初将10微升剧烈涡旋的分生孢子悬液点样于含有15毫升最小培养基的培养皿中，该培养基含1%（重量/体积）琼脂，每毫升悬液约含2×10⁴个细胞。根据所要研究的发育阶段，将实验培养物进行培养。此处，在30°C下培养三天。

随后，使用无菌解剖刀切取含有菌落的一块琼脂。此处我们从菌落边缘切下一小块楔形琼脂，将其倒置后放入八孔载玻片的孔中。将剧烈涡旋振荡的分生孢子悬液（浓度约为2×10⁴）各10 µL加入含200 µL添加适当补充物的最小培养基的八孔载玻片各孔中。

每次孵育的时间和温度应根据实验要求进行选择。显微镜的选择取决于可用的设备。无论何种情况，显微镜的配置都应包括倒置显微镜载物台、环境控制舱，或至少配备一个具有精确空气温度控制的房间。

首先将恒温器和显微镜腔室预热，以稳定至所需温度。此处将温度设定为30摄氏度。打开显微镜、扫描仪电源、激光电源和计算机，并启动成像软件。

将先前准备好的载玻片放置在显微镜载物台上并进行聚焦。选择包含孤立、不重叠或至少不过于密集的细胞的视野，以便在图像分析期间便于测量细胞生长情况。选择要使用的透射光显微技术，并在需要时激活透射光检测器以及荧光检测器。

将显微镜设置为按所需时间间隔采集图像，并开始时间序列图像采集。图像的加载、可视化和处理通过开源的 ImageJ Fiji 软件完成。首先使用插件按格式将图像导入 Fiji。

选择默认的颜色模式和自动缩放。为了将时间戳和比例尺作为叠加显示，请进入分析（Analyze）菜单，选择工具（Tools），然后选择比例尺（Scale Bar）。设置比例尺的宽度、高度、颜色和位置等所需参数。

转到“图像”→“属性”，以在 ImageJ Fiji 软件中显示图像属性。观察帧间隔信息。此处我们使用约 15 分钟的时间间隔，然后点击“确定”。

然后转到图像、堆栈、标签，并将间隔设置为正确的信息。通过修改 X 和 Y 来设定标签的位置。在文本字段中设置测量单位，然后点击预览。通过选择图像、调整、漂白校正、直方图匹配，对不同帧之间的照明进行校正。

一个经过光照校正的新窗口将出现。使用插件中的 MtrackJ 插件（插件 → MtrackJ）来追踪菌丝尖端的生长。要添加轨迹，请在工具栏中选择“添加”按钮，然后通过鼠标左键单击在菌丝尖端放置第一个点。时间序列将自动跳转到下一帧。

要完成追踪过程，请在最后一个点上双击鼠标，或按下 Esc 键。在滚动输出表格时，计算菌丝尖端生长速度最重要的列为任意给定帧的速度。为安全保存追踪数据，请选择“文件”→“另存为”，并以您选择的文件格式（例如 CSV）保存，然后将保存的文件导入电子表格程序中，以进行可视化分析和进一步的统计检验。

按下电影按钮，生成包含已绘制轨迹帧的电影，该电影为 RGB 彩色类型，可在任何标准多媒体播放器中查看。按照本方案，我们捕获并分析了与丝状真菌构巢曲霉（aspergillus nidulans）不同生长和发育阶段相对应的多种图像。图中显示了野生型与 azhAD Delta ngnA Delta 生长速率测量值的比较。

azhAD Delta ngnA Delta 是一种双基因缺失菌株，缺失的两个基因参与了有毒副产物L-添加二羧酸的解毒与同化过程。在液体深层培养中，该菌株的生长速率与野生型菌株相比具有统计学上显著的降低。然而，在固体最小培养基上通过测量菌落面积时，这两种菌株之间的生长差异无法被检测到。

单细胞长期活体成像在获取细胞内蛋白质动态时空信息方面具有重要意义。本方案同样适用于开展长期活细胞成像实验。此处展示的是共表达GFP标记的核心eisosome蛋白PilA和mRFP标记的组蛋白H1的分生孢子萌发过程。本文介绍了一种无需使用者具备任何前期图像分析经验，即可以可重复且可靠的方式分析真菌生长动力学的实验方案。

本方案可实现对真菌生长的客观准确量化。