通过红外激光辅助微图形化技术控制细胞几何形态

微图案化是一种强大的技术，科学家利用它来理解细胞形态与细胞内分子机器活性之间的关联。尽管已有多种技术可让研究人员调控细胞形态，但这些技术通常需要某些生物学实验室难以获得的专业设备。本视频将指导您完成在商用多光子成像系统上实现微图案化自动化的必要步骤。

本方案的一个优势在于无需使用专用设备。此外，图案可轻松更改，而无需重新制作光刻掩模，后者通常是微图案化过程中最耗时的步骤。我们的图像处理工具能够以无偏且自动化的方式生成平均细胞图像，反映蛋白质的代表性分布情况。

尽管我们在实验中使用盖玻片，但自动化工作流程也允许您在载玻片和玻璃底培养皿上进行图案化。该方法的可视化演示非常重要，因为正确的显微镜设置对于系统实现成像、识别正确的焦平面以及自动图案化至关重要。请按照说明制备PVA溶液。

将一份 HCl 加入八份 PVA 中。轻轻倒置离心管数次以混匀。取两毫升该溶液加入小型培养皿中，并将一块洁净的预处理盖玻片浸入液体中。

在摇床上室温孵育5分钟。小心地将盖玻片从溶液中取出。使用盖玻片旋转涂布仪旋转涂布40秒。

在此期间，清洁镊子。将盖玻片转移至盒子中，并在4°C下过夜干燥。打开显微镜软件。

首先，将激光线设置为 750 纳米。然后建立一种名为“图像”的新光学配置。这是基础光学配置，可使我们通过反射物对盖玻片进行成像。

保留其他选项为默认设置，并选择合适的物镜。在此光学配置下设置硬件参数。将红外激光器设为我们的刺激激光器。

将分光镜放入光路中，以使用红外激光进行成像。选择振镜扫描单元和相应的D扫描探测器。选择足以捕捉盖玻片上微小特征的扫描尺寸和停留时间。

确保选中“使用红外激光”选项。调节激发激光功率和探测器灵敏度，以获得明亮但未饱和的盖玻片表面图像。在扫描区域窗口中，将缩放倍数设置为1，以捕获整个视野。

保存光学配置。现在我们将设置一系列光学配置，以实现显微镜的自动聚焦、加载感兴趣区域（ROI）掩模并自动生成图案。第一种光学配置允许我们打印用于在当前视野中自动聚焦的基准标记。

复制图像光学配置并将其重命名，打印定位标记。由于此步骤中需要进行打印，将分光镜移出光路，并替换为合适的二向色镜。选择最小的扫描尺寸以节省时间。

由于此步骤无需成像，将检测器灵敏度设为零。提高激光功率以启用打印。在扫描区域窗口中，将缩放调至最大，并将扫描区域置于视野中央。

现在我们将设置一个Z轴层扫实验，以校正PVA表面可能存在的不平整。将Z轴位置的移动模式设为相对移动，并选择合适的Z轴设备。

接下来，复制图像光学配置并将其重命名为“自动聚焦”。在扫描区域窗口中选择最小的扫描尺寸，并降低放大倍数，使视野略大于基准标记。这可以确保盖玻片上的其他微小特征不会干扰自动聚焦。

在“设备”菜单中，选择“自动聚焦设置”。将扫描厚度设置为Z轴堆叠实验中的厚度。显微镜将扫描此范围，并利用定位标记找到最佳焦平面。

接下来，复制图像光学配置并将其重命名为“加载 ROI”。将扫描尺寸设置为与 ROI 掩膜相同，因为该掩膜将被加载到使用此光学配置拍摄的图像上。我们使用了 2048 像素，以在分辨率和速度之间达到最佳平衡。

现在我们将设置用于在盖玻片上形成图案的光学配置。复制打印定位标记的光学配置，并将其重命名为“Micropattern”。将缩放系数设置为1。

增加刺激激光功率以消融PVA。选择合适的扫描速度。在ND刺激窗口中，设置一个ND刺激实验。

在时间计划中添加若干相位，并将每个相位设置为刺激模式。确保刺激区域和持续时间正确。在同一窗口中，启用每个相位前的载物台移动主 Z 轴功能。

这再次补偿了Z方向上的任何偏差。最后，设置一个光学配置，在盖玻片上生成一个可见标记，以帮助我们定位图案。复制打印基准标记并将其重命名为“Label surface”。

显著增加激光功率，并将缩放倍数设置为1。将涂有PVA的盖玻片转移至样品 holder 上。对于直立显微镜，确保PVA表面朝下。

向盖玻片边缘加水以固定盖玻片。将载物台支架安装到显微镜载物台上。降低物镜，并在物镜与盖玻片之间加水。

在显微镜软件中，打开红外激光快门，并在进行图案化之前执行自动对准。切换至成像光学配置。在缓慢移动物镜靠近盖玻片的同时，扫描视野。

最初，图像会显得非常暗淡。将物镜向盖玻片靠近，直至图像亮度略有增加。此时对准物镜的是盖玻片的表面。

继续移动物镜，直到亮度下降后再次上升。此即为我们将要进行图案化的PVA表面。对准任意微小特征（如盖玻片缺陷或灰尘）进行聚焦，并将Z轴驱动器归零。

切换至标签表面光学配置。点击“Capture”（捕获）。返回成像并进行扫描。

玻璃损伤表明标签已成功打印。将载物台移动一到两个视野，以避免玻璃颗粒。扫描确认。

在设备菜单中，打开载物台移动宏。将变量 M 和 N 设置为需要进行图案化的视野数量。保存并运行该宏。

图案化完成后，切换至成像光学配置并扫描各个图案。每个视野中的图案岛应具有清晰的边界，并均匀反射光线。若图案显得较暗且不均匀，则表明聚乙烯醇（PVA）未完全去除。

这通常是由于激光功率不足或焦平面不正确所致。如果激光功率设置过高，也可能导致PVA产生气泡。在盖玻片上接种细胞后，细胞应充分铺展并呈现图案的形状。

这是一张人成纤维细胞在十字弓图案上培养的免疫荧光图像。该细胞显示出富含肌动蛋白的片状伪足边缘，两侧有较粗的腹侧应力纤维，以及由横向弓状纤维连接的背侧应力纤维。

肌球蛋白轻链位于致密的片状伪足边缘后方，并沿肌动蛋白束呈现条纹状分布。利用我们定制的图像处理工具，生成了目标蛋白的平均图像。该图像显示，上述肌动蛋白结构在大量样本中具有一致性。

尽管在平均化处理后我们失去了肌球蛋白的单个结构，但其沿肌动蛋白束的定位得以保留。观看本视频后，您应能够使用市售的多光子系统，以极少的手动操作建立微图案化工作流程。优化您自身系统的激光功率非常重要，以避免产生不完整的图案或PVA。通过调整自动对焦和微图案化步骤中的参数，可实现最高效率。

除了研究涉及细胞形态的细胞通路外，该技术还可应用于药物筛选及其他对细胞形状变化敏感的领域。