使用激光切割模板的简易无光刻单细胞微图案化技术

我们将介绍一种基于模板的、无需光刻的单细胞微图形化方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的诸多障碍。这些模板可重复使用，且该过程成本低廉、可定制。该方法为非工程领域研究人员开辟了新途径，使其能够在多种生理和病理条件下研究细胞形态和面积诱导的机械转导。

此外，该方案可实现数千个细胞的微图形化，可用于在培养皿中进行高通量药物筛选和疾病建模。视频演示将有助于植入两个关键步骤：从水凝胶上脱离盖玻片，以及在放置掩膜前充分干燥水凝胶。按照论文所述，在一个新的50毫升聚丙烯离心管中配制聚丙烯酰胺水凝胶溶液。

接下来，配制5%光引发剂溶液：将组分溶解于700微升100%乙醇中。这些组分不溶于水，因此务必通过涡旋充分溶解。加入300微升PBS，最终体积为1毫升。

在冰上操作，使用预冷的 DMEM F12 培养基或 1× PBS 将基底膜基质蛋白储备液稀释至优化的稀释比例。置于冰上保存，以备后续使用。处理基底膜基质时，务必始终在冰上操作，并使用预冷的溶液以及冷藏过的移液器吸头和离心管。

将紫外台式灯放置于生物安全柜中。随后，放入先前制备好的已灭菌石蜡膜。如果石蜡膜未完全干燥，使用真空抽吸系统去除任何残留液体。

使用已灭菌的镊子，将六个已灭菌的盖玻片分别放置于每个培养皿中的石蜡膜上。为制备紫外光交联型聚丙烯酰胺终溶液，将光引发剂溶液与聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液混合稀释。使用孔径为0.22微米的50毫升滤器装置对溶液进行灭菌处理。

然后将200 µL的紫外光交联型聚丙烯酰胺终溶液分别加入六个培养皿中的每一片玻璃盖玻片上。使用已灭菌的镊子，小心地用另一片盖玻片覆盖每一片盖玻片，使溶液层夹在两片盖玻片之间。将含有盖玻片的培养皿置于紫外灯下，培养皿盖保持打开状态。

将白色纸张覆盖在非白色表面上，以最大限度减少紫外光强度的损失。为防止紫外线辐射，需用铝箔包裹光源。将聚丙烯酰胺水凝胶进行五分钟的光聚合。

使用剃刀刀片小心地分离每一对盖玻片。用 PBS 填充含有六个水凝胶盖玻片复合物的储液槽。用 PBS 冲洗五分钟之后，将水凝胶盖玻片复合物重新放回培养皿中的石蜡膜上。

从–80摄氏度保存条件下取出一管 Sulfo-SANPAH。向管中加入1,200微升预冷的PBS，通过上下吹打混匀。将200微升稀释后的 Sulfo-SANPAH 滴加到培养皿中的石蜡膜上。

将水凝胶盖玻片复合物覆盖在 Sulfo-SANPAH 上，使水凝胶与 Sulfo-SANPAH 接触。接着，将水凝胶盖玻片复合物置于紫外灯下，照射 5 分钟以激活 Sulfo-SANPAH。若 Sulfo-SANPAH 颜色由橙色变为棕色，表明激活和结合成功，需在 10 分钟内进行后续步骤。

用新鲜的 PBS 补充分离的一次性聚丙烯储液槽。将活化的水凝胶盖玻片复合物转移至储液槽中，短暂冲洗以去除未结合的 Sulfo-SANPAH。将水凝胶盖玻片复合物放置在培养皿中的石蜡膜上，并用无菌无绒擦拭布小心吸干。

将模板放置在每个水凝胶盖玻片复合物的顶部。为确保模板与复合物之间形成紧密密封，用经高压灭菌的无绒擦拭纸轻轻吸去多余水分。小心地将稀释的基底膜基质蛋白溶液滴加到每个水凝胶盖玻片复合物上，每片加入200微升。

将构建物在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，将复合物转移至六孔板中。通过观察基质蛋白溶液是否保留在模板上方，可轻松验证水凝胶与模板之间是否形成紧密密封。

未能形成紧密的密封会导致蛋白质溶液迅速从孔洞中泄漏。将复合物完全浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用已灭菌的镊子，小心地将模板从水凝胶上剥离，避免撕裂水凝胶。

吸去孔中的 PBS，用 DMEM 重新填充各孔。将培养板在 37 摄氏度下孵育过夜。从孵箱中取出培养板后，检查 DMEM 的状态。

如果DMEM不浑浊，则水凝胶盖玻片复合物已可直接用于细胞接种。已制备出含有方形和矩形阵列的模板。利用这些模板制备了微图案化水凝胶基底，并获得了基质蛋白岛。

也获得了细胞岛。例如，由人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞形成的细胞岛。基质蛋白浓度在生成适当图案的过程中起着关键作用。

最佳浓度可导致蛋白质的均匀分布。基质蛋白溶液浓度不理想会导致图案化效果不佳。必须使用模板的正面。

如果使用模板的背面，由于激光切割方向的原因，基质蛋白岛的尺寸会增大。尽管使用模板的背面并未显著影响矩形图案的宽度，但其高度显著增加，导致预期的长宽比降低。基于模板的图案化技术已应用于硅弹性体基底。

通过低倍镜下心脏肌钙蛋白T的免疫细胞化学染色，以及高倍镜下肌节蛋白α-肌动蛋白的染色，观察硅基弹性体基底上图案化的心肌细胞。基于模板的图案化技术还被用于在不同硬度的水凝胶上并排构建两个心肌细胞的图案。人类诱导性多能干细胞的发现及其相应的分化方案，使得这一模型成为体外研究肿瘤发生和疾病发病机制的理想人类模型。

然而，使用iPS系统的一个主要局限性在于缺乏具有特定生化组成和刚度的微环境结构，而这种结构对于与细胞相互作用至关重要。图案化技术可与牵引力显微镜和免疫细胞化学检测相结合，用于表征心肌细胞的结构与功能。在更接近生理形态的条件下分析iPS诱导的细胞类型（在本例中为心肌细胞），为在培养皿中研究具有挑战性的心肌细胞行为提供了新的机会。

该技术还可应用于许多其他系统，例如高内涵筛选板。其形状和基底可根据具体应用需求轻松调整。