评估初级纤毛的人工智能方法

目前的纤毛分析方法费时费力，且容易产生误差和偏差。我们的方法旨在简化所需时间和工作量，同时减少潜在错误。该技术的主要优势在于提高了实验的严谨性、可重复性以及定量图像分析能力。

此类方法不仅适用于纤毛分析，还可广泛应用于许多细胞生物学问题，包括涉及其他细胞器和细胞骨架蛋白的研究。首先，打开训练数据集，从菜单中选择文件，点击导入导出，然后选择从文件序列创建 ND 文件。选择包含训练数据集的文件夹，文件列表将出现在对话框窗口的中央。

使用下拉菜单中的至少一个选项手动定义文件的组织方式。在每个选定的选项下输入相应的数值，未选择的选项请设为“无”。点击“转换”以打开 ND 文档。

为校准图像，右键单击图像左下角的未校准选项。点击校准文档，然后点击像素大小，输入数值并点击确定。选择查看分析控件，打开二值化工具栏，选择自动检测或手动绘制对象，通过在所有打开的帧上精确描记单个纤毛结构来手动识别纤毛。

进行人工智能训练时，选择 nis. ai，点击 train segment. ai 以打开训练模块。

ai box，然后选择用于训练的源通道。选择适当的GroundTruth二值图像以训练AI。根据二值图像的大小和分布，选择所需的训练迭代次数，然后选择目标文件夹以保存训练好的AI文件，并点击“train”开始训练软件。此过程需要数小时。

按照之前所述方法，通过将样本的 .TIF 文件转换为 ND2 文件，打开纤毛的实验共聚焦图像。在弹出窗口中，从第一个下拉菜单中选择“多点”，并输入与图像总数相对应的数值。

在第二个下拉框中，选择波长并将数值更改为文件夹中通道的总数。软件将自动解锁位于弹出窗口底部右端的波长选择窗口。在波长选择窗口中，使用颜色下拉菜单为每个通道选择对应的颜色。

在名称列中为每个通道指定不同的名称。更新所有信息后，点击转换。按照之前所述方法对图像进行校准。

确保实验数据集的像素大小与训练数据集一致。使用上一步中训练好的人工智能模型在第一通道中识别纤毛。打开 nis。

从菜单中选择“segment.ai”，然后在源通道中选择AC3。接着通过在源通道中选择MCHR1来识别第二通道上的纤毛。

软件将在标记的纤毛上绘制二值化区域。接下来检查图像中是否存在误识别的二值化区域。在二值化工具栏中选择删除对象，以手动删除误识别的二值化区域。

在纤毛被识别并分割后，使用通用分析三工具分析不同的纤毛参数，例如长度和强度。从菜单中选择图像，然后点击新建GA3方案。此时将打开一个中心带有空白区域的新窗口。

GA3 将自动检测根据人工智能标注的适当二进制文件，并包含相应的节点。GA3 还将自动检测图像中的通道，并在通道下方显示其标签页。人工智能将对帧内所有类似纤毛的结构进行分割，并检测帧边缘处不完整的纤毛。

要移除它们，请选择二值化处理、移除对象，然后将“接触边界”节点拖入空白区域，并将该节点连接到相应的二值图像节点。要测量纤毛长度，请选择“测量对象大小”，然后选择“长度”。将参数拖放到中心位置，并连接到相应的二值图像节点。

为了测量纤毛的强度，选择某些对象的强度。将参数拖放到中心位置，并连接到相应的二值化节点和目标通道。在测量菜单中，进入对象比率分析，选择曼德系数，通过测量单个纤毛内两个通道的重叠程度，在 GA3 中建立共定位分析通路。

将Mander's系数节点拖放到空白区域，并将其连接到相应的二值图像和通道。通过打开数据管理菜单来展开测量结果和单个表格。在基本类别中，选择ApEn列，然后点击“立即运行”以测量纤毛。

所有测量结果将显示在同一个输出表格中。代表性图像显示，训练后的AI能够正确识别IMCD细胞、原代下丘脑培养细胞和海马培养细胞图像中的纤毛，而不会将细胞质桥等非纤毛结构误识别为纤毛。IMCD细胞中纤毛长度范围为0.5至4.5 µm，下丘脑和海马培养细胞中纤毛长度范围为2至12 µm。

人工智能在弓状核、室旁核和海马CA1区的图像中，测量了体内AC3标记的纤毛长度。根据分析结果，下丘脑纤毛在体内的长度范围为1至15微米，如白色和棕色柱状图所示；而海马CA1区的纤毛长度范围为1至10微米，如灰色柱状图所示。

有趣的是，室旁核中纤毛的MCHR1信号强度强于弓状核。通过绘制MCHR1与AC3信号强度的关系图来评估二者的共定位情况。大多数纤毛同时表达这两种标志物，但也有部分纤毛仅表达AC3或MCHR1中的一种。

为了定量分析MTHR1在AC3内的共定位情况，测量了Mander重叠系数，结果显示室旁核中的重叠程度显著高于弓状核。为了测量纤毛长度方向上的强度分布，使用Centrin2-GFP作为基体标记物来定义纤毛的极性。这有助于区分ARL13B-Mcherry阳性纤毛的基部与尖端。

在弓状核（左侧所示）以及室旁核（PVN，右侧所示）中，观察到 ARL13B 在纤毛长度方向上的强度变化，表现为 ARL13B 在纤毛基部的信号强度高于其在纤毛顶端的信号强度。在使用该方法分析数据时，重要的是确保实验数据集的质量和分辨率与用于训练人工智能模型的数据集一致。该方法的主要优势在于，通过人工智能检测纤毛后，用户可自定义软件内集成的分析流程，灵活选择需分析的纤毛特性。