利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

本方案为非同源末端连接（NHEJ）分析提供了一种高通量且可靠的检测方法，可用于确定基因编辑蚊群中插入缺失（Indel）突变的发生频率及相对数量。与下一代测序或桑格测序相比，数字滴定PCR（ddPCR）具有更快的结果周转时间，从而能够对转基因生物的遗传变异进行快速而全面的分析。该方法应可普遍适用于所有实验系统。

演示该实验步骤的是来自杨氏实验室的研究助理Thai Pham。首先，按照文中所述比例，加入数字滴定PCR（ddPCR）超混合液、正向与反向引物、HEX或FAM探针、DNA和水，配制25微升的数字滴定PCR（ddPCR）样品混合液。然后通过涡旋充分混匀反应体系。

使用50微升多通道移液器，将20微升ddPCR样品混合液加入芯片的中间排孔中。然后使用200微升多通道移液器，向底部排孔加入70微升油相，注意在整个移液过程中避免产生气泡。放置垫圈时仅触碰边缘，避免接触中心凹陷区域，随后将芯片牢固地放入液滴生成仪中，并关闭盖子以启动运行。

使用多通道移液器将试剂盒顶行中的浸润混合液转移至96孔板中，以30至45度的角度缓慢滴加40微升液体样本，持续3至5秒。然后以45度角缓慢排液超过3秒，使液体沿孔壁流下，再将移液器按至第二档彻底排出液体。使用铝箔热封膜在180摄氏度条件下密封板材5秒。

将密封的反应板放入热循环仪中，并按照NHEJ片段脱落的指导原则设置PCR反应条件：首先在95 °C下进行初始变性10分钟；然后进行40个循环，每个循环包括94 °C变性30秒，55 °C退火1分钟，以及60 °C延伸2分钟；40个循环结束后，在98 °C下保持10分钟，最后在4 °C下保存。

所有步骤的升降温速率为每秒2摄氏度。退火温度将根据所使用的探针或引物而变化。将反应板牢固地放入液滴读取仪中，确保A1孔位于左上角。

打开程序，通过将FAM设定为已知参考通道，HEX设定为每个孔的未知通道，来设置反应板。然后，更改每个样本的名称。运行液滴读取实验，进行直接定量，同时保存模板。

为软件分析设定正确的实验参数，包括样本信息、超级混合液、目标名称、目标类型、信号通道一和通道二。然后，将液滴计数的阈值设置为高于10,000，以获得可靠结果。接下来，在液滴标签页中检查每个孔的液滴数量，确保所有孔的液滴数均高于10,000。

最后，检查一维幅度以有效分离阳性信号与阴性信号。在板编辑器中，选中整块板，将实验类型设置为“drop off”。将野生型（WT）靶标设为参考，指定FAM为第一通道，HEX为第二通道。

将NHEJ靶标设为未知，指定通道一用于FAM，通道二不使用。在二维振幅选项卡中，使用图形工具为每个样本设置聚类阈值。在NHEJ检测中，尾部通常与野生型（WT）聚类相关联。

在“比例”标签页下，点击图表右上角的齿轮图标，选择“fractional abundance”以绘制对应NHEJ事件百分比的点。对15个独立提取的样本（每个样本包含10只蚊子）进行分析，这些样本中含有多种NHEJ等位基因，通过“drop off”检测方法进行鉴定，结果显示所有15个样本均携带100%的Indel等位基因。在另一项实验中，使用本ddPCR方案检测了11个独立提取的样本，其中包括野生型蚊子以及含有不同NHEJ百分比的NHEJ蚊子。

结果显示，所鉴定出的百分比与通过扩增子分析技术检测到的插入缺失（Indel）结果相近。移液时应缓慢操作以避免产生气泡，并使所有乳化的液滴沿孔壁流下。